181104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 41200 RP jelű, immunitást fokozó anyag előállítására
11 181104 12 fenolra 109 ml vizet használunk). A reakcióelegyet erőteljes keverés közben 65°-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten a keverést 30 percig folytatjuk. Ezután a reaktort jégfürdőben gyorsan 25°-ra lehűtjük, és a fázisokat úgy választjuk el, hogy 30 percig 4 liter befogadóképességű JOUAN típusú K 63 F laboratóriumi centrifugán 3300 g-vel centrifugáljuk. Ily módon 450 ml vizes fázist kapunk. A fenolos fázist és a fázisok közötti réteget 65°•on 1 liter ionmentesített vízzel 30 percig újra extraháljuk, a fent jelzett módon való hűtés és centrifugálás után újabb 1470 ml vizes fázist kapunk. A vizes fázisokat egyesítjük. A fenolt 2 egymásutáni, egyenként 2 liter kloroformmal való mosással távolítjuk el. A vizes fázisokat ezután 30 percig tartó, 3300 g-vel való centrifugálissal derítve, 1800 ml vizes fázist kapunk. Ezt a vizes fázist 3 napig +4°-on 40 liter ionmentesített vízzel szemben háromszor dializáljuk. A maradékot liofilizálva, 14,5 g amorf fehér port kapunk. Ennek a pornak 8 g-nyi mennyiségét 400 ml, 7 pH-jú, steril, 0,1 mólos nátriumacetát pufferben oldjuk (a pufferoldatot úgy állítjuk elő, hogy 136,09 g analitikai tisztaságú nátriumacetátot 0,9 liter ionmentesített vízben oldunk, majd az oldat pH-ját 1,049 fajsúlyú ecetsav hozzáadásával 7,0-ra állítjuk be és literre kiegészítjük, a sterilizálást 45 percig 122°-on végezzük, ezt az oldatot pontosan a felhasználás előtt steril ionmentesített vízzel 1 : 10-re hígítjuk). A kapott oldatot 13,5 cm átmérőjű, 65 cm magas és +4°-os hideg szobában felállított EPHAROSE CL 4B oszlopon 0,1 mólos, 7,0 pH-jú, steril nátriumacetát pufferrel kromatografáljuk. Az eluálást ugyanilyen pufferoldattal óránként 1,33 liter sebességgel végezzük és az eluátum abszorpcióját 230 nm-nél folyamatosan regisztráljuk. Az elsőként kapott, 3,13 liter eluátumot kiöntjük. A következő 1,22 liter frakciót, amely a 230 nm-nél lévő abszorpció maximumnak felel meg, regenerált cellulózból készült NOJAX tömlőbe töltjük, és +4°-on 3 napig 40 liter ionmentesített vízzel szemben háromszor dializáljuk, majd az 1300 ml maradékot liofilizáljuk. A kapott szilárd anyagot 93 ml ionmentesített vízben felvesszük, és ugyanazzal a membránnal, mint fent, 48 óra hosszat +4 -on 20 liter ionmentesített vízzel szemben kétszer dializáljuk. A maradékot liofilizáljuk. Dy módon 1,3 g 41200 RP jelű anyagot kapunk. Jellemzői a következők: kinézése: amorf fehér por, ultraibolya spektruma: ez a spektrum az 1. ábrán látható, infravörös spektruma: (káliumbromiddal kevert sajtolt tablettával meghatározva). Ezt a spektrumot a 2. ábra szemlélteti, ezen az ábrán abszcisszaként egyrészt a mikronokban kifejezett hullámhosszak (felső lépték), másrészt a cm-1-ben kifejezett hullámszámok (alsó lépték) és ordinátaként az átbocsátás százaléka van (eltüntetve. A követKezo táblázatban a 41200 RP anyag infravörös abszorpció sáyjainak főbb adatait közöljük cm'1 hullámszámban kifejezve. 3420 cm'1 tF (amely H2 O) 1440 cm 1 ép. 900 cm"1 f 3280 cm'1 ép. 1405 cm'1 ép. 875 cm'1 f 3090 cm'1 ép. 1375 cm'1 F 800 cm"1 m 2970 cm'1 ép. 1335 cm'1 ép. 775 cm"1 f 2950 cm'1 ép. 1310 cm"1 m 720 cm"1 ép. 2920 cm'1 F 1230 cm'1 m 630 cm"1 ép. 2845 cm'1 m 1210 cm"1 ép. 560 cm"1 F (amely H20) 2680 cm"1 ép. 1160 cm"1 F 520 cm"1 ép. 2100 cm'1 tf 1115 cm'1 F 480 cm"1 ép1730 cm'1 ép. 1060 cm"1 tF 450 cm"1 ép. 1645 cm'1 tF 1025 cm"1 ép. 400 cm"1 ép. 1545 cm'1 F 945 cm"1 m 365 cm"1 ép. 1460 cm'1 ép. tF = nagyon erős, f gyenge, F = erős, tf = nagyon gyenge, m = közepes, ép, = széles váll. összetétel: víz (Fischer módszerrel meghatározva) = 3,8%, száraz anyagra számítva: aminosavak = 12,3% (ebből 7% alanin), glukóz = 11,95%, nukleinsavak = 1,3%-nál kevesebb (ultraibolya spektrum alapján), aminocukrok = 16,3%. Elemi összetétel: C = 45,58%, H - 7,47%, N = 4,85%, O = 37%, P = 1,17%, Cl = 0,25%, Na = 2,36%, Ca = 1,33%, S = 0,5%-nál kevesebb. Elektroforézis 8,6 pH-jú barbital puffert tartalmazó, 1%-os agaróz gélben 6 V/cm feszültség alatt a 41200 RP jelű anyag óránként körülbelül 11 mm sebességgel az anód felé vándorol. (A terméket időnkénti oxidáció után Schiff reagenssel vagy Soudan B feketével mutattuk ki.) 2. példa Az 1. példa A) szakasza szerint járunk el. 16 órai tenyésztés után a tenyészetet 4°-ra hűtjük és pH-ját sósavval 3-ra állítjuk be. A sejteket percenként 4000 fordulattal centrifugálva különítjük el. A savas sejttömeget ezután autoklávban 45 percig 122°-on melegítjük, majd lehűtjük, etanollal mossuk és szárítjuk. Ezután az 1. példa B) és C) szakaszai szerint járunk el, és azonos mennyiséget használva, amorf fehér por alakjában 0,55 g 41200 RF anyagot kapunk. Jellemzői a következők: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
