181104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 41200 RP jelű, immunitást fokozó anyag előállítására
7 181104 8 eus sedogenes M78 törzset alkalmas körülmények között tenyésztjük, majd a tenyésztés folyamán elszaporodott sejteket elkülönítjük. A Micrococcus sedogenes M 78 törzs tenyésztését bármely felületi vagy süllyesztett tenyésztési módszerrel végrehajthatjuk, de kényelmi okokból a süllyesztett tenyésztés előnyösebb eljárás. Erre a célra beoltási és fermentálási eljárásokat és különféle típusú olyan készülékeket használunk, amelyeket a fermentáló iparban szokásosan alkalmaznak. A fermentáló közegnek lényegileg asszimilálható szén-, nitrogén-, foszfor- és kénforrásokat, ásványi elemet és adott esetben növekedést elősegítő anyagokat kell tartalmaznia, mindezeket az anyagokat jól meghatározott termékekként vagy bonyolult összetételű anyagokként adjuk hozzá úgy, amint a különféle eredetű biológiai termékekben előfordulnak. Asszimilálható szénforrásként szénhidrátokat, például dextrineket, keményítőt vagy más széntartalmú vegyületeket, például alkoholokat (etanolt) vagy egyes szerves savakat, például tejsavat, citromsavat használhatunk. Bizonyos állati vagy növényi olajok, például bálnaolaj vagy szójababolaj előnyösen helyettesíthetik ezeket a különféle szénforrásokat vagy ezekkel együtt használhatók. Az alkalmas asszimilálható nitrogénlórrás nagyon változatos lehet. Ezek nagyon egyszerű vegyi anyagok, például az ammónium szervetlen vagy szerves sói vagy bizonyos aminosavak lehetnek. De hozzáadhatunk olyan bonyolult összetételű anyagokat is, amelyek a nitrogént főleg proteines alakban tartalmazzák, ilyen például a kazein, laktalbumin, sikér és ezek hidrolizátumai, szójaliszt, földimogyoró-liszt, halliszt, húskivonat, élesztő, szeszgyári törköly-desztilláció oldható maradéka és kukoricalekvár. A ként és foszfort általában elegendő mennyiségben tartalmazzák az előbbiekben említett, bonyolult összetételű szerves adalékanyagok. Szulfátok és fősz-, fátok alakjában is hozzáadhatjuk a táptalajhoz. A hozzáadott ásványi elemek közül egyeseknek pufferoló vagy közömbösítő hatásuk lehet, mint az alkálifoszfátoknak, alkáliföldfémfoszfátoknak, kalciumkarbonátnak vagy magnéziumkarbonátnak. Mások a Micrococcus sedogenes M 78 törzs fejlődéséhez szükséges ion-egyensúlyt biztosítják, így az alkálifém- és alkáliföldfémkloridok és szulfátok, valamint a cink, kobalt, vas, réz és mangán sói. A fermentáló közeg pH-jának a tenyésztés kezdetén 6,0 és 7,8 között, előnyösen 6,5 és 7,5 között kell lenni. A fermentálás legkedvezőbb hőmérséklete 25 és 30 °C között van, de kielégítő termelést lehet 20 és 35 °C közötti hőmérsékleten is elérni. A fermentálás folyamán a levegőztetés mértéke eléggé tág határok között változhat. Mégis azt tapasztaltuk, hogy a folyékony táptalaj literenként és percenként 0,3—1 liter levegővel való levegőztetésével különösen jó eredményeket érhetünk el. A maximális kitermelést 8-20 óra, előnyösen 15 óra hosszat tartó tenyésztéssel éljük el és az időtartam lényegileg a használt közegtől függ. A tenyésztés befejezésekor a fermentáló közeg pH-ja általában 7,3 és 8,8 között, előnyösen 8,0 és 8,4 között van. Ezután a Microcococcus sedogenes M78 törzs mikroorganizmusait a fermentáló közegből szűréssel vagy centrifugálással választjuk el, előnyösen azután, hogy a közeget ásványi sav, például sósav hozzáadásával 3 pH-ra megsavanyítottuk. Az utólagos kezelés céljára az így kapott sejteket nyers állapotban használhatjuk fel, vagy liofilizáljuk vagy alkohollal vagy acetonnal mosva, csökkentett nyomáson szárítjuk, hogy száraz, tisztított sejteket kapjunk. A találmány szerinti, új 41200 RP jelű anyagnak jelentős és hasznos biológiai tulajdonságai vannak. Egerekbe intravénásán, szubkután. intraperitoneálisan vagy nazálisán beadva, a találmány szerinti anyag jelentős mértékben fokozza az egerek ellenállását olyan fertőzéssel szemben, amelyet virulens baktériumtörzsek, például Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, valamint vírusok, például encephalomyocarditis vírus, patkány-hepatitisz vírus, influenza vírus (egerekre adaptált A0 és A2 típusú emberi vírus), sömörvírus és Semliki-Porest arbovirus rendszerint halálos adagjaival idéztünk elő. A megnövekedett ellenállási állapot a kezelés után legalább 96 óráig megmarad. Egerekbe parenterálisan beadva, ez a termék erősen fokozza a retikulo-endoteliális rendszer fagocitózis képességét, és növeli a lépben az antitesteket termelő limfociták számát. Serkentő hatást gyakorol a késleltetett típusú túlérzékenységi reakciókra és a sajátos antigének elleni antitestek termelésére. Daganatsejtekkel, például 180 szarkóma sejtekkel beoltott egerekben ez a termék elősegíti a daganat kidobását, elüszkösítő reakciót idézve elő ezen a helyen. A találmány szerinti termék bizonyos körülmények között növeli a lép T limfocitáinak számát és/vagy citolitikus hatékonyságukat az allogén daganatsejtekkel szemben. Egerekkel végzett állatkísérletekben a használt kísérleti rendszerektől és a beadás módjától függően, a hatásos adagok 0,03 és 3 mg/kg között, előnyösen 0,3 és 1 mg/kg között vannak. Egyetlen kezelés általában elegendő arra, hogy a kívánt hatást 48 óránál rövidebb idő alatt elérjük. Egerekbe intravénásán beadva, a 41200 RP jelű anyag 50% halálozást előidéző adagja (DL50) közel 23 mg/kg. A következőkben a proteineket az aminosavak elemzése alapján határozzuk meg, a glükózt antron-módszerrel határozzuk meg, a foszfort elhamvasztás után molibdát-módszerrel határozzuk meg, a nukleinsavtartalmat 258 nm-nél az abszorpcióból állapítjuk meg, az aminocukrokat Elson-Morgan módszerrel határozzuk meg és glükózaminként fejezzük ki vagy hidrolízis és Biotronik LC 6000E autoanalizátor segítségével való elválasztás után ninhidrin reakcióval határozzuk meg. A következő példák a találmány gyakorlati megvalósítását szemléltetik, de semmiképpen nem korlátozzák. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. 5 10 !5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 55 4
