181031. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergozin előállítására
7 181031 8 5 ml-re bepároljuk, és annak 2 ml-ét kovasavgélen fluoreszcens indikátor mellett végzett preparatív rétegkromatográfiával (oldószer-rendszer: 8 : 2 arányú kloroform-etanol elegy) szétválasztjuk. Az alkaloid foltot lekaparjuk és 45 :45 : 10 arányú víz-metanol-jégecet eleggyel felvesszük, majd ezt követően 1 : 2 arányban van Urk-reagenst [H. W, van Urk, Pharm. Weelebl. 66, 473 (1929)] adunk hozzá. A kékre színeződött oldatokat centrifugáljuk, a felülúszót kvarc lámpával 5 percig besugározzuk, és az extinkciót fotométerrel mérjük. Az alkaloid mennyiséget az azonos körülmények között felvett kalibrációs görbéről olvashatjuk le. Ezen törzs alkaloid keverékének a következő az összetétele: ergozin: 65%; ergozinin: 25%; klavinok: 10%. A peptid-típusú alkaloidok preparatív kinyerését a következőképpen hajthatjuk végre: 2,5 liter táptalajt alkalikusra (pH = 9) állítunk be és kloroformmal idmerítően extraháljuk. Az egyesített extraktumokat vákuumban bepároljuk. Ebből maradékként 690 mg nyers alkaloid keveréket kapunk. Ezt az anyagot kevés kloroformban feloldjuk, és kovasavgél oszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként kloroformot alkalmazunk, melyhez növekvő mennyiségben (15%-ig) etanolt adunk. Két elkülönült, UV-fényben kéken fluoreszkáló zóna kép-’ ződik. A gyorsabban vándorló zóna adja az ergozinint. Metanolban végrehajtott átkristályosítás után 150 mg ergozinint (C30H37O5N5) kapunk 225 °C-os olvadásponttal. [a]p9 = +394° (c = 1%, kloroform). Nagy feloldóképességű tömegspektrum m/e: 547 (Mf); talált: 547,2807; számított: 547,2794 a C30H37O5N5 képletre. További prominens fragmensek m/e: 280, 267, 224, 221, 210, 167 és 154. A lassabban vándorló zóna eluátuma 350 mg ergozint (C30H37OSN5) tartalmaz. Tömegspektrum m/e: 547 (M+). További prominens fragmensek m/e: 280, 267, 224, 221, 210, 167 és 154. Mindkét esetben a Keller- [C. C. Keller, Schwez. Wschr. Chem. Pharm. 34, 65 (1896)] és a van Urk-reakció pozitív, és az abszorpciós spektrum UV-ben À = 312 mju-nál maximumot mutat. Savas hidrolízisnél mindig leucin és prolin keletkezik. Az alkalikus hidrolízis Uzergsavat (az eigozinnál), illetve izolizergsavat (az ergozininnál) szolgáltat. A két izolált peptid-típusú alkaloid kromatográfiás viselkedése is megegyezik az autentikus ergozin, illetve ergozinin viselkedésével. Az alkaloidok önmagában ismert módszerek szerinti egymásba történő átalakítása tehetsége*. 3. példa Ferde csövecskékből kiindulva az 1. példában leírt eljárás szerint 100 ml 815 jelű táptalajt tartal- 5 mazó 500ml-es rázólombikokban előkultúrákat indítunk be. A 815 jelű táptalaj összetétele a következő: szacharóz 300 g, kh2po4 0.5 g, 10 NaNC>3 2,0 g, élesztő kivonat 0.1 & FeS04 * 7H20 10 mg, MgS04 • 7H20 0.6 g, KC1 0,5 g, J5 víz 1000,0 ml-ig. pH (sterilizálás előtt): 5,5-5,8. Sterilizálás: 30 perc 110 °C-on. Az 1. példában megnevezett körülmények között 20 végzett inkubálás után az előkultúra 10%-át 100 ml 833 jelű tápközeget tartalmazó 500 ml-es rázólombikba visszük át. A 833 jelű tápközeg összetétele: szacharóz 300 g, 25 ammónium-citrát 20 g, Ca(N03)2 1 g, kh2po4 0,25 g, MgS04 • 7H20 0,3 g, FeS04 • 7H20 10 mg, 30 ZnS04 • 7H20 30,8 g, víz 1000,0 ml-ig. pH (sterilizálás előtt): 5,4-5,7. Sterilizálás: 30 perc 110 °C-on. 35 Az 1. példában megnevezett körülmények között végzett 14 napos inkubálás után a lombikok 180-200 jug/ml, az 1. példában megadott összetételű össz-alkaloid-tartalommal rendelkeznek. 40 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás ergozin előállítására, azzal jellemezve, hogy Claviceps purpurea (Fr) Túl. MUT 168 (IMET PA 134) törzset folyékony, szénforrást, nitrogén-45 forrást és ásványi sokat tartalmazó tápközegben 20-30 °C-os hőmérsékleten, 4,0-6,2 pH-értéknél 10—35 napos időintervallumban aerob szubmerz vagy felületi fermentációban kultiválunk, és a keletkezett, mintegy 90% ergozin/ergozinint és mintegy 50 10% könnyen leválasztható klavin alkaloidokat tartalmazó alkaloid keveréket szokásos módon izoláljuk és elválasztjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatoskáxi módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 55 22-25 °C hőmérsékleten és 5,2-5,9 pH-értéknél hajtjuk végre. 1 ábraoldal A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 84.4268 - Zrínyi Nyomda, Budapest 4
