180898. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás VIII. koagulációs faktort tartalmazó készítmény előállítására mélyhűtött emberi plazmából
180898 3 652 530 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertették. A fenti ismert módszerekkel olyan csapadékot kapunk, amely — amint említettük — vérzékenység elleni faktort (VIII. koagulációs faktort) és fibrinogént tartalmaz, s ez utóbbit eléggé nagy mennyiségben. Az egyszerű, azonban meglehetősen időigényes eljárásokkal viszonylag kedvező, 30—40%-os termelés érhető el a vérplazma teljes VIII. koagulációs faktor tartalmára vonatkoztatva. Az alkohol alkalmazása következtében és a megfagyasztott plazma lassú felolvasztása miatt a VIII. koagulációs faktor némiképpen denaturálódik, úgy, hogy csökken a biológiai aktivitása és ezzel együtt a „felezési ideje”, azaz azon idő, amely alatt a biológiai aktivitás az eredeti érték felére csökken. Az ismert eljárásokkal nyert készítmények lényeges fogyatékossága, hogy csekély az oldhatóságuk. Emiatt 35— 100 ml folyadékra is szükség van ahhoz, hogy 500 egység VIII. koagulációs faktornak megfelelő készítménymennyiséget oldatba vigyünk, s ezért orvosi segítség szükséges az infúzióhoz. A vérzékenységben szenvedő betegek célszerű kezelése már ma is, de a jövőben egyre inkább megköveteli, hogy a beteg saját magának befecskendezze a hiányzó vérfaktort. Az orvosi segítség nélkül beadható injekciómennyiség azonban nem haladhatja meg a 20—30 ml térfogatot, ezért szükség van arra, hogy a tennék igen jól oldódjon, és így a 20—30 ml oldattérfogat körülbelül 500 egység vérzékenység elleni faktort tartalmazhat. Ez a nagy koncentrációjú (nagy tisztaságú) készítményekkel érhető el, amelyek a hidegen képződött csapadékokból vagy a Cohns-féle I—0 frakcióból a fentebb ismertetett módon állíthatók elő a lecsapott termék több lépésben történő tisztításával, azaz amikor a lényegében a fibrinogént távolijuk el, például a 3 652 530 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint. Az ismert eljárásokkal előállíthatok ugyan igen jó oldhatósággal rendelkező készítmények, amelyeknél az 500 egység VIII. koagulációs faktor feloldásához — az alkalmazott módszertől függően — 15—25 ml folyadéktérfogat szükséges, azonban igen jelentős hátrányokkal kell számolnunk. Jelentősen csökken ugyanis a kitermelés, mivel a vérplazmában jelenlevő vérzékenység elleni faktor mennyiségének mindössze 10—20%-a különíthető el. Emellett erősen csökken a felezési idő, csupán 4—5 óra, míg a natív VIII. koagulációs faktor felezési ideje 12 óra. Tekintettel arra, hogy a kiindulási anyag csak korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre, mindez természetesen problémát jelent. A találmány célja egyszerű és gyors eljárás kidolgozása jól oldódó, VIII. koagulációs faktort tartalmazó készítmény nagy termeléssel történő előállítására a mélyhűtött vérplazma felolvasztása, a hidegen képződött csapadék pufferoldatban történő oldása, a koncentrált oldat elkülönítése és kivánt esetben fagyasztva szárítás útján. A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy a vérplazma és frakcióinak hosszadalmas kezelésekor a plazmafehérjék elbomlanak, s így a kitermelést és az oldhatóságot növelhetjük, ha a mélyhűtött vérplazma felolvasztását és a hidegen képződött csapadék elkülönítését lehetőleg rövid idő alatt, a hőmérséklet pontos szabályozása mellett, vegyi anyagok távollétében végezzük, mivel ilyen módon csökkentjük a VIII. koagulációs faktor bomlásának mértékét. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a fenti követelményeknek úgy tehetünk eleget, hogy a felolvasztást vagy legalábbis annak utolsó szakaszát elektromágneses hullámokkal — előnyösen mikrohullámokkal vagy infravörös sugárzással — történő besugárzással végezzük. A kezelés akkor történik, amikor a vérplazma még steril körülmények között abban a zacskóban helyezkedik el, amelyben mélyhütve lett. Előnyösen 200 ml térfogatú zacskót alkalma- 5 zunk. A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy a gyors felolvasztás nemcsak a VIII. koagulációs faktor szempontjából nagy jelentőségű, hanem ez a kezelés valamennyi plazmafehérjét kíméli. így a találmány szerinti eljárás más plazmafehérjék 10 elkülönítésére irányuló eljárásoknál is kedvező. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a megfagyasztott plazmát 10s—1015 Hz frekvenciájú elektromágneses hullámokkal történő besugárzással egészen vagy részben felolvasztjuk. A besugárzást annyi idő alatt és olyan energia- 15 adaggal végezzük, hogy a felengedett vérplazma hőmérséklete soha ne lépje túl a 10 °C értéket. Meglepő módon azt találtuk, hogy egyrészt a terméket igen kedvező termeléssel kapjuk — a termelés a vérplazmában jelenlevő VIII. koagulációs faktor mennyiségének az 20 50%-át is elérheti —, másrészt megnövekszik a termék felezési ideje, ezen felül pedig rendkívül nagy a termék oldhatósága. így lehetővé válik az, hogy 500 egységnek megfelelő mennyiséget 25 ml folyadéktérfogatban oldjunk. 25 Feltételezzük, hogy a találmány szerinti eljárás körülményei között a felolvasztás során igen csekély mértékben denaturálódik mind a VIII. koagulációs faktor, mind pedig a fibrinogén, s így ezek oldhatósági tulajdonságai nem romlanak. 3C Korábban már felismerték, hogy bizonyos klinikai helyzetekben, például szívműtétek során fellépő erős vérzéseknél, szükség van arra, hogy az orvosok gyorsan nagy mennyiségű vérplazmával rendelkezzenek. Bizonyos plazmakomponensek, így a vérplazmából hidegen képződött csapadék beveze- 35 tése sem mindig elégséges a beteg vérzésének csillapításához. Mivel a mélyhűtött plazma felolvasztása hosszú időt vesz igénybe, szükség van arra, hogy nagy mennyiségű felolvasztott plazma álljon felhasználható állapotban rendelkezésre. Amikor azonban a vérplazmát felolvasztott állapotban tart- 4C juk, nem kívánt bomlás lép fel, így a koagulációs faktorok bomlása is bekövetkezik. A problémamegoldására Sherman és Dorner [Transfusion, 14, 595—597 (1974)] azt javasolta, hogy használat előtt a plazmát mikrohullámokkal kell felolvasztani úgy, hogy a betegeknek közvetlenül beadható le- 45 gyen. Más szavakkal, a vérplazmát olyan hőmérsékletre kell melegíteni, amely a beteg testhőmérsékletének közelében van (37 °C). Sherman és Dorner azonban azt is megállapította, hogy közvetlenül a felolvasztás után a plazmában jelenlevő koagulációs faktorok nem bomlanak ugyan nagyobb mérői tékben, mint amikor a felolvasztás hagyományos módszerrel történik 37 °C-ra, a VIII. koagulációs faktorból elbomlott mennyiség azonban az eredeti értéknek körülbelül 25%-át is kiteszi. Sherman és Dorner azt tapasztalta, hogy a felolvasztott egész plazma veszélytelenül beadható, ha arra szükség 55 van, nem foglalkoztak azonban azzal az esettel, amikor a feladat az egyes faktorok kinyerése a plazmából. Ellenkezőleg, hangsúlyozták, hogy szükség lehet egyes esetekben bizonyos faktorok hozzáadására. Összehasonlításul megjegyezzük, hogy ha a vérplazmát a 60 találmány szerint felolvasztjuk, és Sherman módszerével analóg módon meghatározzuk a VIII. faktort, akkor a VIII. faktor teljes mennyiségének 90—100%-a ismét megtalálható a plazmában. Ebből körülbelül 60—70% van a hidegen képződött csapadékban, míg a többi a csapadék feletti oldatban 65 oldott állapotban helyezkedik el.
