180894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 3-[/S-1'-fenil-etil-amino]-propilamino bleomicin gyógyászati szempontból elfogadható sói előállítására
7 180894 Az (a) eljárásban használt bleomicinsav ismert vegyület, amelynek előállítása a 3 843 448 és 3 846 400 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett módszer szerint a bleomicin B2 enzimatikus hasításával történhet. A másik kiindulási anyag, azaz az N-[(S)-l’-fenil-etil]-l,3- -diamino-propán új vegyület, melyet elsőként szintetizáltunk. A szintézis a következőképpen történik: Körülbelül 0 °C hőmérsékletre lehűtött feniletilamint megközelítően ekvivalens mennyiségű akrilnitrillel keverünk el. Az elegyet a reakció teljessé tétele céljából 10—24 órán át 80 —100 °C-on tartjuk. Ezután az akrilnitril feleslegét csökkentett nyomáson végzett desztillálással eltávolítjuk, és a maradékot tovább desztillálva a 3-[(S)-r-fenil-etil-amino]-propionitrilhez jutunk. Az így kapott vegyületet szokásos módon, például Raney-nikkel jelenlétében redukálva a kívánt N-[(S)r-fenil-etil-l,3-diaminopropán (a továbbiakban „aminovegyület”) keletkezik. E vegyület és dihidrokloridja fizikaikémiai tulajdonságait a következő 7. táblázatban adjuk meg. 7. táblázat Szabad bázis Dihidroklorid (1) Megjelenés Szobahőmérfehér tűs sékleten színtelen folyadék kristály (2) Olvadáspont — 223,5—224 °C (3) Forráspont 95—103 °C (2Hgmm) — (4) Ultraibolya 241, 247,252, 250, 256, 259, abszorpciós 257, 263, 267 266 (desztillált maximum (m p) (metanol) víz) (5) Molekuláris — 206 (desztillált extinkciós koefficiens e (256 m p) (6) Fajlagos forgatóvíz) képesség —20 ,6° (c = 1, K — desztillált víz) K —56,38° (hígítás nélkül, (7) Rf-érték vékonyréteg kromatográfiásan, n-propanol-piridin-ecetsav-víz (15:10:3:12 térf. arány) Avicel 1=1) —SFR (8)Rm-érték nagyfeszültségű elektroforézissel hangyasav-ecetsav-víz (25:75:900 térf. arány) Avicel— SFR lOmin., Rm (ala-0,73 0,73 nin) = 1,0 1,52 1,52 ö 7. táblázat Szabad bázis Dihidroklorid 700, 760, 820, 690, 750, 820, 910, 1025, 910, 980, 1020, 1080, 1130, 1065, 1075, (9) IR abszorpciós 1200, 1305, 1150, 1205, spektrum cm ~l, 1350,1370, 1385, 1460, KBr 1450, 1495, 1500, 1515, 1605, 2850, 1590,2500, 2940,3300, 2850, 3000, 3375 3500 (10) összegképlet c„h18n2 CiiH20N2C12 (molekulasúly) (178, 28) (251,20) Aktiválószerként a következő vegyületek használhatók fel: 6-klór-l-p-klórbenzol-szulfoniloxi-benzotriazol (CCBT), N-etil-5-fenil-izoxazólium-3’-szulfonát (NEPIS), N-terc-butil-5-metil-izoxazólium-perklorát, N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolin, di-p-nitrofenil-szulfit tri-p-nitrofenil-foszfit, p-nitrofenil-diklóracetát, N-hidroxi-szukcinimid, diciklohexil-karbodiimid (DCC), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid, l-ciklohexil-3-(2-morfolinoetil)-karbodiimid, difenil-karbodiimid, di-p-toluil-karbodümid, diizopropil-karbodiimid, p-nitrofenol, pentaklorfenol és benzilalkohol. Az (a) eljárás részletes ismertetését a következőkben adjuk meg: Bleomicinsavat (réztartalmú forma) feloldunk vízben, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban vagy ezek elegyében. A kapott oldathoz 0—30 °C hőmérsékleten, keverés közben, hozzáadjuk a fent felsorolt aktiválóreagensek egyikét. A kapott oldat pH-értékét 3—10-re állítjuk be, ami alkalmas körülményeket teremt az aktiválás számára. A pH beállítása valamely szervetlen sav vagy bázis, így például sósav vagy nátriumhidroxid vagy egy szerves sav vagy bázis, például triklórecetsav vagy N-metil-morfolin segítségével történhet. A kezelés hatására megindul a bleomicinsav karboxilcsoportjának aktiválása. A reakcióelegyet azonnal vagy a kezelést követő 30 percen belül elkeverjük az aminovegyülettel. Adott esetben a pH értéket előzőleg 7,0-ra állítjuk be. Az elegyet ezután 1—24 órán át 0—30 °C-on tartjuk. Ilyen körülmények között lejátszódik a reakció és az NK631-hez jutunk. Az aktiváló reagenst vagy az amino-vegyületet a bleomicinsav 1/mól-ekvivalensnyi mennyiségére vonatkoztatva alkalmasan 1—10 ekvivalens mennyiségben használjuk. Az NK631-SÓ elkülönítése céljából először a bleomicinvegyületeket a reakcióelegy térfogatára számítva 5—10 térf. aceton hozzáadásával kicsapjuk. A kapott csapadékot szűréssel összegyűjtjük, acetonnál mossuk, és a lehető legkisebb mennyiségű desztillált vízben feloldjuk. A kapott vizes oldat pH-értékét azonnal beállítjuk 6,0-ra, például sósav-oldat segítségével, és felöntjük egy CM-Sephadex® C—25 gyantával töltött (NHÎ típus, a Pharmacia Fine Chemicals gyártmánya) kromatografáló oszlopba, amelyet előzőleg vizes ammóniumklorid oldattal kezeltünk. Az el nem reagált bleomicinsav adszorpció nélkül halad végig az oszlopon. A gyantán adszorbeált NK631-et gradiens eluálási technikával vizes ammóniumklorid oldattal eluáljuk, a koncentrációkat lépcsősen vagy folyamatosan 0,05 mólról, 1,0 mólra növelve. Az NK631-et a kék színű frakciókban találjuk, körülbelül 0,35—0,45 mól ammóniumklorid koncentrációk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
