180892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9-(hidroxi-alkil)-purin-származékok előállítására
7 180892 8 Másik módszer erithro-9-(2-hidroxi-3-nonil)-hipoxantin előállítására. [erithro-9-(2-Hidroxi-3-nonil)-adenin dezaminálásával.] 5,6 g (71 mmól) nátrium-nitritet adunk lassan, keverés közben 4,0 g (14 mmól) erithro-9-(2-hidroxi-3-nonil)-adenin 20 ml 50%-os ecetsawal és 3,2 ml 1 n sósavval készült oldatához 25C°-on. A reakcióelegyet 2 óra hosszat keveijük 25 C°-on. Utána ultraibolya spektrumot veszünk fel. Ha az ultraibolya elnyelési maximum 250 nm-nél lesz, az oldatot 2 n nátrium-hidroxid oldattal semlegesítjük. A kapott csapadékot kiszűrjük, és vízzel mossuk. Kitermelés: 3,03 g (75%). Olvadáspont: 195 C°. A termék egy részét analitikai minta céljára háromszor átkristályosítjuk vízből, így 202 C° olvadáspontú terméket kapunk. Az analízis eredményei a C14H22N402 összegképlet alapján: számított: C % 60,40; H % 7,96; N % 20,13; talált: C % 60,40; H % 7,90; N % 20,12. Ultraibolya színképe: X max X . min koncentráció 10 ~3 * pH 250 224 12,1 7 248 222 13,3 1 254 220 14,1 10 Egerek in vivo kezelése. Lépsejtek szaporodásának concanavalin A által in vitro kiváltott stimulációjára gyakorolt hatás A vizsgálat célja az, hogy meghatározzuk egerek NPT 15392 vegyülettel való in vivo kezelésének hatását ezen állatokból izolált lépsejtek későbbi működésére, és értékeljük in vitro szaporodási válaszukat a concanavalin A (Con A) mitogénre. Eljárás. In vivo kezelés. Kilenc darab 8—9 hetes korú, 18—20 g súlyú hím Balb/C egeret két csoportba osztunk. Az egyik csoportot naponta kétszer (1 napig), reggel és délután, szájon át beadott 10 mg/kg NPT 15392-vel kezeljük. A második csoport placebo kontrollként sóoldatot kap. In vitro lépsejt vizsgálat: sejtpreparálás. A következő napon mindegyik csoportot leöljük, a lépeket eltávolítjuk, és összegyűjtjük. A lépeket felaprítjuk, és a sejteket RPMI—1640 tápoldatban (Grand Island Biologicals gyártmánya) mossuk, amelyhez adalékként 2 mmól glutamint és antibiotikumokat adtunk. Az egyes preparátumok sejtkoncentrációját sejtszámlálóval meghatározzuk, és RPMI tápoldattal 5 • 106 sejt/ml koncentrációra állítjuk be. Mikrotiter lemez-meghatározás. A mikrotiter meghatározásokat 0,2 ml inkubációs térfogatban végezzük, amelyben 5 • 105 sejt és Con A vagy Con 5 A és a megfelelő vegyület van a megadott koncentrációkban. Minden egyes meghatározást 6 párhuzamos kísérletben végzünk, és csak sejteket tartalmazó vakpróbával hasonlítjuk össze. A vizsgálati lemezeket 37 C°-on 4 napig inkubáljuk 5% széndioxidot tartalmazó légtérben. Az inkubálás utolsó 10 18—20 órájában 0,5 ml 3HTdR-t (triciált timidint) (10 pCi/ml; 6 Ci/mmól) adunk minden egyes tenyészethez. A tenyészeteket többcsatornás automatikus mintagyűjtő egységgel (MASH-unit) összegyűjtjük, és a beépült 3HTdR-t Beckmann LS 8000 folyadékszcintillációs számlálóval hatá- 15 rozzuk meg, ezt tekintjük a sejtszaporodás mértékének. Az eredményeket a Con A-val vagy a ConA-val és a megfelelő vegyülettel kezelt tenyészetben és a kontroll tenyészetekben talált aktivitás arányaként táblázatba gyűjtjük. A 15392 jelzésű vegyülettel történő in vivo kezelés fokozza 20 a lépsejtek ezt követő válaszát in vitro Con A stimulációra szuboptimális mitogén koncentrációnál (5 pg/ml). A 15392-vel kezelt egerekből izolált lépsejtekben 120:1 stimulációs arányt észleltünk a placebóval kezelt egerekből izolált lépsejteknél észlelt 40 :1 arányhoz viszonyítva. 25 Vizsgáltuk a Con A-val stimulált sejtek ezt követően in vitro 1 pg/ml NPT 15392 vegyülettel való kezelésének hatását is. Mindkét vegyület kifejezett képességet mutat a Con A stimuláció fokozására, különösen a szuboptimális mitogén koncentrációnál (5 pg/ml), és kisebb mértékben 30 10 pg/ml-nél, Az 5 pg/ml Con A koncentrációnál az NPT 15392 által kifejtett stimuláció 2,8-szerese az egyedül a Con A-énak. Ezek az eredmények a vegyületek immunomodulátor ha- 35 tását jelzik a lépsejt-szaporodásra. Az állatoknak a vegyületek valamelyikével való előkezelése érzékenyíti a sejteket az ezt követő mitogén stimulációra, míg a sejtek in vitro ezt követően mitogén stimulációt okozó vegyületek hatásának való kitétele fokozza a szaporodási választ. 40 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás I általános képletű 9-(2-hidroxi-alkil)-purin- 45 származékok előállítására — ebben a képletben R1 jelentése 5—8 szénatomos alkilcsoport, és R2 jelentése metilcsoport — azzal jellemezve, hogy a) egy II általános képletű 6-amino-purint — ahol R1 és 50 R2 a fenti jelentésűek — diazotálunk, majd hidrolizáljuk, vagy b) egy VI általános képletű 6-klór-purint — ahol R1 és R2 a fenti jelentésűek’— hidrolizálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja 55 9-(2-hidroxi-3-nonil)-hipoxantin előállítására azzal jellemezve, hogy a) 9-(2-hidroxi-3-nonil)-adenint diazotálunk, majd hidrolizáljuk, vagy b) 9-(2-hidroxi-3-nonil)-6-klór-purint hidrolizálunk. 3 rajz A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 84.5127.66-4 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató
