180783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozinÓ1(inex lent) és/Asn2(index fölt)/-analógjai előállítására
17 180783 18 tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, majd szárítjuk. Az így kapott 11,4 g (21,6 mmól) dipeptid-hidrokloridot 140 ml dimetílformamidban oldjuk, az oldathoz 0 C°-on 8,8 g (21,6 mmól) Boc-Thr(Bzl)-OSu-t és 3,5 ml Et3N-t adunk, és az clegyet 24 órán át 25 C°-on keverjük. Ezalatt az elegyhez az enyhén lúgos kémhatás fenntartására néhány csepp Et3N-t adunk. Az elegyet 5 ml ecetsavval megsavanyítjuk, majd nagy mennyiségű vízzel hígítjuk. A kivált nyers, szilárd terméket elkülönítjük, etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd bepároljuk. Az üvegszerű, szilárd maradékot etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 13,8 g (83,7%) Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 110—112 C\ [u]^5= + 19,45° (c= 1, etilacetát). 41,5 g (54 mmól) Boc-ThríBzl)-Thr( B/l)-Lys(Z)-OH-t 25 percig 500 ml frissen készített 3,55 n tetrahidrofurános sósavoldattal reagáltatunk. Az elegyet szirupszerű maradékká bepároljuk, és a maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és éterrel mossuk. A kapott 37,4 g nyers tripeptidhidrokloridot 500 ml dimetilformamidban oldjuk, és az oldathoz 0 C°-on 17,4 g (53 mmól) Boc-IIe-OSu-t, majd 16 ml Et3N-t adunk. Az elegyet éjszakán át 25 C°-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez részletekben összesen 6,2 ml Et,N-t adunk. A kapott elegyet szűrjük, és a szürletet bepároljuk. Az olajos maradékot etilacetáttal extraháljuk, a szerves oldatot 5%-os vizes ecetsavoldattal és vízzel mossuk, nátriumázulfát fölött szárítjuk, majd bepároljuk. A sárgás, olajos maradékot etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 39,6 g nyers szilárd terméket kapunk (op.: 140—142 C°), amely kis mennyiségben számos szennyezőanyagot tartalmaz. A terméket 70—230mesh szemcseméretű szilikagéllel töltött, 4,7 x 67 cm méretű oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként 95 : 5 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használunk. Az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan elemezzük. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és az olajos maradékot kloroformból és petroléterből kristályosítjuk. 19,1 g (41,2%) Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 144—146 C°, [a]“= +2,40° (c = 1, kloroform). 0,439 g (0,496 mmól) Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 30 percig 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk, és a reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk. 0,39 g HCl • H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk. 0,59 g (0,492 mmól) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2-t 6 ml dimetilformamidban oldunk, az oldathoz -25 C°-on 0,57 ml 4,3 n tetrahidrofurános sósavoldatot (2,46 mmól) adunk, és az elegyhez azonnal 0,1 ml (0,74 mmól) izoamilnitritet adunk. A reakcióelegyet 30 percig - 20 C° és — 25 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd - 35 C-ra hűtjük, és 0,42 ml Et3N-t és 0,39 g, a fentiek szerint előállított HC1 • H-lle-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t adunk hozzá. Az elegyet 30 percig —20C°-on, majd 48 órán át 4C°-on keverjük; ezalatt az elegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával körülbelül 7,5 értéken tartjuk. A kapott elegyet 250 ml 5%-os vizes ecetsavoldattal hígítjuk. A kivált szilárd anyagot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd vákuumban szemcsés nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 0,82 g nyers terméket kapunk; op.: 244—254 C°. A nyers terméket dimetilformamidban oldjuk, és metanollal kicsapjuk. 0,698 g (81,7%) Boc--Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-I!e-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 268—271 C°. 0,408 g (0,68 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 10 ml dimetilformamiddal készített, —20 C°-os szuszpenziójához 0,627 ml frissen készített 5,43 n tetrahidrofurános sósavoldatot (3,4 mmól), majd 1,39 ml 10%os dimetilformamidos izoamilnitrit-oldatot (1,03 mmól) adunk. Az elegyet 30 percig keverjük, majd —30 C°-ra hűtjük, és 0,476 ml (3,4 mmól) Et3N-t és 1,334 g (0,68 mmól) TFA ■ H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t adunk hozzá. Az elegyet 30 percig —20 C°-on, majd 5 napig 4C°-on keverjük; ezalatt az enyhén lúgos kémhatás fenntartására és a gélképződés megakadályozására az elegyhez Et3N-t és DMSO-t adunk. A reakcióelegyet 300 ml 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált szilárd csapadékot leszűrjük, ví2zel, metanollal és éterrel mossuk, és szárítjuk. 1,49 g 296 —299 C°-on olvadó anyagot kapunk. A terméket dimetilszulfoxidban oldjuk, és metanollal kicsapjuk. 1,40 g (85,37%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val--Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; [a]” =+6,37° (c = 1, DMSO). 1,35 g (0,558 mmól), a fentiek szerint kapott tetradekapeptid, 0,188 g (1,23 mmól) HOBT ■ H20, 15 ml dimetilformamid és 15 ml dimetilszulfoxid elegyét néhány percig keverjük. Az elegyet jégfürdőn lehűtjük, 0,126 g (0,614 mmól) DCC-t adunk hozzá, és ugyanezen a hőmérsékleten további 24 órán át keverjük. Egy külön reakcióedényben 4,0 g (1,43 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 25 percig 40 ml trifluorecetsawal reagáltatunk, és a kapott tetradekapeptid-trifluoracetátot nagy mennyiségű éterrel gyorsan kicsapjuk. A kivált szilárd anyagot leszűrjük és éterrel alaposan mossuk. Fehér, porszerű anyagként a C-terminális tetradekapeptid trifluorecetsavas sóját kapjuk; hozam: 3,74 g. A korábban ismertetett módon, dimetilformamid és dimetilszulfoxid elegyében kialakított aminoterminális tetradekapeptid aktív észteréhez 1,567 g (0,5583 mmól), az előzőek szerint kapott tetradekapeptidtrifluoracetátot adunk. Az elegy pH-ját néhány csepp NMM-el 7,5 és 8,0 közötti értékre állítjuk, és a reakcióelegyet 1 órán át 0C°-on, majd 5 napig 25C°-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet 1,5 liter 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált csapadékot vízzel, metanollal, dimetilformamiddal, metanollal, végül éterrel alaposan mossuk. 2,21 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp-(OBzl)-Thr( Bzl)-Ser(Bzl )-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; a tennék 300 C°-nál magasabb hőmérsékleten olvad. 2,21 g (0,435 mmól), a fentiek szerint kapott védett oktakozapeptidet 8 ml trifluorecetsav és 4 ml anizol elegyében oldjuk, az oldathoz vízmentes hidrogénfluoridot adunk, és az elegyet 30 percig 0 C°-on keverjük. Az elegyet vákuumban 0C°-on bepároljuk, és a szilárd maradékot 200 ml vízben oldjuk. Az oldatot éterrel kétszer mossuk, eredeti térfogatának felére bepároljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. A kapott 1,1 g nyers terméket tisztítás céljából 3 x 80 cm méretű Sephadex G—10 oszlopon (eluálószer: 0,2 mólos ecetsav-oldat), majd 3 x 75 cm méretű DEAE-Sephadex oszlopon bocsátjuk át; eluálószerként növekvő koncent5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
