180746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 jelű antibiotikum előállítására
25 180746 26 100 1 steril, az előbb megadottal azonos összetételű termelő táptalajt oltunk. A beoltott termelő táptalajt 165 1-es tankfermentorban tenyésztjük 6—8 napon át 30 C° hőmérsékleten. A táptalajt 1 atmoszféranyomáson steril levegővel levegőztetjük oly módon, hogy a táptalaj levegő-telítettsége 30% felett legyen ; a keverést percenként 200—300-at forduló konvencionális keverővei végezzük. 2. példa Az A—21978C antibiotikum keverék elkülönítése Az 1. példában megadottak szerint kapott kb. 6500 liter teljes fermentlevet 3% szűrési segédanyag (Celite 545, Johns—Manville Products Corp.), hozzáadása után szűrőprésen szűrjük. A szűrési maradékot vízzel mossuk, amiután összesen 4100 liter 230 egység/ml aktivitású szűrlelet kapunk. A szűrlet pH-ját hidrogén-kloriddal 3,5-re állítjuk be, majd az aktív komponensek kicsapására 16 órán át állni hagyjuk. A szuszpenzióhoz 0,75% Celite 545 szűrési segédanyagot adunk, majd szűréssel elkülönítjük a csapadékot. A szűrési maradékot 2x450 liter metanollal extraháljuk, szűrés előtt minden esetben 1 órán át keverjük. A 720 liter össztérfogatú egyesített metanolos extraktum 0,1 térfogat (72 liter) vizet adunk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 6,5— 7,0-ra állítjuk be. Az oldal térfogatát csökkentett nyomáson eredeti térfogatának l/20-ára csökkentjük (30 liter) a metanol eltávolítására. A koncentrálás közben szükség szerint desztillált vizet adagolunk. Keverés közben 3/4 térfogat (22 1) n-butanolt adagolunk. A kapott oldat pH-ját 3,0-ra állítjuk be hidrogén-kloriddal. Elkülönítjük a fázisokat, az n-butanolos fázist, amelyben az antibiotikum van, csökkentett nyomáson töményítjük. A desztillációs maradékot a lehető legkevesebb metanolban oldjuk, a metanolos oldatot 30-szoros menynyiségű acetonhoz öntjük az A—21978C keverék nagy részének kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amiután 247 g nyers A—21978C keveréket kapunk, amelynek biológiai aktivitása 780 egység/mg. Az A—21978 keverék további részét (A és B komponensek), tartalmazó metanol-acetonos szűrletet desztilláljuk. A desztillációs maradékot tercier-butanol és viz 5 : 1 arányú elegyében oldjuk, az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 169 g A—21978 keveréket kapunk. 3. példa A) Az A—21978C keverék tisztítása 734 g, a 2. példában megadottak szerint előállított nyers A—21978C keveréket 25 1 vízben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját 5N nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be az anyag teljes feloldására. Az oldatot 21 7 acetát-ciklusú IRA 68 ioncserélő gyantát (Rohn és Haas Co.), tartalmazó oszlopra öntjük. 4 oszlopnyi térfogatú (108 1) vízzel mossuk a gyantát, majd 5 oszlopnyi térfogatú (135 I) 0,1N ecetsavval. Az aktív anyagot 0,5N ecetsavval eluáljuk, miközben körülbelül 120 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakció biológiai aktivitását meghatározzuk. A leginkább aktív frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 278 g barna színű A—21978C keveréket kapunk, amelynek biológiai aktivitása 1100 egység/mg. A kisebb aktivitású frakciókat összegyűjtjük, amiután 880 egység/mg biológiai aktivitású barna színű, 238 g súlyú A—21978C keveréket kapunk. B) Az A—21978C keverék további tisztítása 150 g az IRA—68 gyantáról eluált aktívabb A—& 21978C keveréket 600 ml vízben szuszpendálunk, a szuszpenzió pH-ját oldat készítésére 6,5-re állítjuk be. A vizes oldat adszorpciójára nagy mennyiségű száraz szilikagélt (Grace, Grade 62) adunk az oldathoz. Ezt a nedves szilikagélt 30 1 szilikagélt (Grace 62) tartalmazó 10 x 375 cm méretű acetonitrillel kiegyensúlyozott oszlopra töltjük. A szilikagélt előzőleg a finom szemcsék eltávolítására vízzel mossuk, ezután vízben szuszpendált szilikagéllel töltjük az oszlopot és 30 1 acetonitrillel mossuk. Az aktiv anyag oszlopra juttatását követően 15 1 acetonitrillel mossuk a gyantát, majd acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével eluálunk, miközben 4 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elúciót biológiai értékméréssel követjük, az értékmérést szilikagél vékonyréteggel végezzük bioautográfiával, a futtató elegy összetétele acetonitril és víz=3 : 1. Az A—21978C keveréket tartalmazó 43—60. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és a desztillációs maradékot fagyasztva szárítjuk, amikor 1160 egység/mg aktivitású sárga-borostyánkő színű, tisztított A—21978C komplexet kapunk. A termék súlya 86,2 g. A D és C faktorokat tartalmazó 21—29. frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 13 g sárga színű, por alakú, alacsony biológiai aktivitású terméket kapunk. A fentiek szerint előállított 30 g tisztított A—21978C keveréket szinmentesítés céljából a lehető legkevesebb mennyiségű vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzióhoz az anyag adszorbeálására kevés szilikagélt (Typé LP—1, 10—20 mikron, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N. Y., 07006) keverünk. A nedves szilikagél keveréket acetonitril és metanol 4: 1 arányú elegyében szuszpendáljuk és 4 x 30 cm méretű üvegoszlopot töltünk meg vele, amely 6,5 x 82 cm méretű, 2,8 1 szilikagéllel Quantum LP—1) van töltve és acetonitril és metanol 4 : 2 arányú elegyével van kiegyensúlyozva. A szilikagélt előzőleg vízzel, majd ezt követően acetonitril és metanol 4 : 1 arányú elegyével mostuk és az oszlopot acetonitril és metanol 4 : 1 arányú elegyében levő szilikagéllel töltöttük 4,2—4,5 atm nyomáson. Az előoszlopot és a főoszlopot 3 1 acetonitril és metanol 4: 1 arányú elegyével mossuk 4,2—4,5 atm nyomáson. Az aktív vegyületet acetonitril, metanol és víz 55 : 2 : 25 arányú elegyével eluáljuk, miközben 300 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az eluálást biológiai értékméréssel ellenőrizzük, a mérést Micrococcus luteus mikroorganizmussal végezzük. A 14—25. frakciók tartalmazzák a hatóanyag nagy részét, ezeket egyesítjük, töményítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután világos sárga színű termékként 24 g tiszta A—21978C keveréket kapunk nátriumsóként. A termék 1250 egység/mg biológiai aktivitású. A 26—32. frakciók kevésbé aktívak, ezeket is összegyűjtjük,.töményítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,6 g. kevésbé tiszta 780 egység/mg aktivitású A— 21978C keveréket kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
