180718. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szalicilsavat vagy sóit és gyógyászatilag alkalmas polimert tartalmazó vegyületek előállítására
19 18071 'S 20 Azt, hogy az azo-csoport redukciójának in vitro vizsgálata felhasználható az in vivo redukció szimulálására, azok a kutatások is alátámasztották, amelyek során orálisan beadott azoszínezékek redukciós termékeinek a bélben Való ’felszívódását tanulmányozták [Honohan, T. és munkatársai, Intestinal absorption of polymeric derivatives of the food dyes sunset yellow and tartrazinè in rats, Xèrfoblofica, 7, 765 (1977)]. A fenti B pont szèrint előállított polimert akklimatizálódott nőstény Simonsen patkányoknak adtuk be (az állatok súlya 200—300 g volt). A nem éhezíetett patkányoknak 20 mg polimert adtunk be (ez körülbelül 30 mikrontól 5-amíiio-szalicilsavat tartalmazott vizes oldatban). Összehasonlítási célokra egy kontroll csoportnak mintegy 40 mikrontól 5-atnino-szalicilsavnak megfelelő mennyiségű szalicii-azo-szulfapiridint adtunk be vizes szuszpenziőban. Meghatározott időközökben vér-, Vizelet- és ürütékminíát vettünk mindkét állatcsoportból. Hansson módszerét alkalmaztuk — kis módosításokkal — a biológiai mintákban jelenlevő 5-amino-szalicilsav kivonásához és mennyiségi meghatározásához. Közelítőleg 1 gramm mintához 1 ml 0,1 mólos foszfát puffert (pH-^6,9) majd 110 egység beta-glukuronidázt adtunk. A mintákat egy éjszakán át inkubáltuk 37 c'C-on 15 ml térfogatúcxtrakciós kémcsövekben. Mindenegyes extrakciós kémcsőbe 25 mikrolitér ecetsavanhidridet töltöttünk, és a kémcsövek tanaimat összekevertük. Ezután 1 ml 1 mólos sósav-oldatot adtunk hozzá, összekevertük, és 5 ml 4-mét iI-2-pen’tanont adtunk hozzá. Az extrákéról 20 percig végeztük rázógépen, percenként #40 rázatássál. À szefvés fázist céhtrlfúgálással elválasztottuk a vizës anyagtól. A 4-métíf-2-pé‘ntár!onból 4 ml-t feltávölítöffiink, és 3 ml 0.5 mólos foszfát pufierrel extráháltuk (a püffer pH-értéke "6,0 volt). Centrifugálás •íitáha Szerves fázist'élöntöttük, és a vizés fázisnak még^határoztuk a huorészcehcíáját AmmCo^Bowmann spekt'roflúoriméter (Model No. SPF—125) segítségével. 295 mm-es gerjesztési hullámhosszúságot (korrigálatlan érték) használtunk, és a fluoreszcenciát 460 mm-nél (korrigálatlan érték) mértük. Standard anyagokat is hasonló módon kezeltünk, mint a mintákat, és az egyes biológiai mintavizsgálatokkal párhuzamosan vizsgáltuk őket. Ilyen módon meghatározhatóvá vált a SASP és a polimerhez kapcsolt 5-ASA három fő anyagcsereterméke: az 5-amino-szaliciIsav glukuronsavval képezett konjugátuma, az 5-amino-szalicifsav N-acílezett anyagcsereterméke és az átalakulatlan 5-amino-szalicilsav. A négy patkánnyal végzett első kísérlet során standard görbéket állítottunk fel 5-amino-szalicilsav alkalmazásával. À hat patkánnyal végzett második kísérletnél azt tapasztaltuk, hogy az 5-amino-szalicilsav N-acetil-származéka a lineárishoz közelebb álló összefüggést ad a 0,5—500 nanomól/g minta koncentrációtartományban. Az 5-amino-szalicilsäv-tartalmat az egyes ex'trakciókra érvényes megfelelő standard görbe alapján számítottuk ki. Az I. számú kísérlet során nagy egyedi eltéréseket tapasztaltunk az 5-amino-szalicilsav kiürülési kinetikájánál és a vérszérumban fennálló koncentrációjánál. Az 1. számú patkány esetében következetesen kevesebb 5-amino-szalicilsav került a vizeletbe és az ürülékbe, mint a másik három állatnál, ezért ezt abnormálisnak tekintettük a kísérlet folyamán kinyert 5-amino-szalicilsav abszolút mennyiségét illetően. Az 1. számú patkány és a másik három állat közötti kvalitatív összehasonlítás azonban következetes irányzatra (trend) mutat. E trendek a következők: a) a vizelet útján kiürült 5-amino-szalicilsav jelentős hányada (87—97%) a 12—48. óra közötti időben távozik ; b) az ürülék útján kiürülő 5-amino-szalicilsav jelentős része (81—93%) a 4—48. óra közötti időben távozik; c) a vérszérumban a maximális koncentráció 12 óra elteltével jelentkezik (a 4 patkány közül háromnál). A négy állat közül háromnál a kinyert 5-amino-szalicilsav mennyisége a számítások szerint meghaladta a 100%-ot (2. táblázat). A kinyert 5-amino-szalicilsavra vonatkozó értékek bizonyos mértékig önkényesek, mivel a standard anyagra vonatkoznak, és úgy kaptuk őket, hogy a kísérleti mintáknál a fluoreszcenciás meghatározással nyert értékeket a standard görbe határértékein kívüli tartományra extrapoláltuk. Ezek az értékek tehát túlságosan nagyok és hibásak, ha kvantitatív értelemben tekintjük őket, ugyanakkor azonban, kvalitatív értelemben, felhasználhatók összehasonlításokhoz. 2. táblázat Biológiái mintákban 5-amino-szalicilsavként és anyagcseretermékéiként meghatározott dózis, százalékban (I. számú kísérlet) Vizsgált hatóanyag Patkány sorszáma Vizelet Ürülék Összes Kinyerés, % SASP ! 2.7 4,7 7.4 18,0 Polimerhez 2 33.2 13,6 46.8 117,0 kapcsolt 3 28.6 17,2 45,8 112,0 5-ASA 4 35,2 7.3 42.5 114,0 A II. számú kísérletnél az 5-arhino-szalicihsav N-acetil-származékát alkalmaztuk standard anyagként, és a fluoreszcenciás vizsgálattal kapott eredmények jobb linearitást mutattak a 0,5—500 nanomól közötti koncentrációtartományban. A kísérleti mintákra kapott valamennyi fluoreszcenciás meghatározási érték a standard görbék által átfogott tartományon belül helyezkedett elés értékelésünk szerint pontosabban tükrözi az 5-amino-szálicílsav-tartálrhat. Ennél a második vizsgálatnál szintén röviÖébb időközöket alkalmaztunk az ürülék és a vizelet összegyűjtésénél, hogy pontosabban határozhassuk meg a kiürülés kinetikáját (3. táblázat). Az 1. számú kísérletnél tapasztalt nagy egyedi változások a II. számú kísérletnél is fennálltak, a trendek azonban nagyon hasonlók maradtak: a) a vizelet útján kiürült 5-amino-szalicilsav jelentős hányada (39—83%) a 12—24. óra között távozik; b) az ürülék útján kiürülő 5-amino-szalicilsav jelentős része (69—98°„) a 8—36. óra között távozik; cl a vérszérumban a maximális koncentráció 12 óra elteltével jelentkezik. Tekintettel arra, hogy a II. számú kísérlet során minden egyes csoportban három állatot vizsgáltunk, a kapott eredményeket statisztikus analízisnek vetettük alá, hogy meghatározzuk az esetleges kvantitatív trendeket (4. és 5. táblázat). A vizelet útján kiürült 5-amino-szalicilsav mennyisége lényegesen nagyobb volt a polimerre! kezelt állatcsoportnál (8,0), mint a szalicii-azo-szulta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
