180484. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil, nagy mértékben immunogén, egy/vagy két jellemzőjében mutált, legyengített salmonella-baktérium mutánsok előállítására élő oltóanyagokhoz
9 180 484 10 Megjegyzések a legyengítéshez és az immunogenitáshoz: Az I. táblázat adataiból látható, hogy a mindenkori Salmonella-faj 106 mutáns-csírájával történő egyszeri i. p. immunizálás esetén a határozott legyengítés folytán 0—14% elhullás következik be a kísérleti állatoknál. Ha kontrollként a mindenkori Salmonella-faj nem legyengített vadtörzséből adunk be ugyanennyi csírát, akkor a kontroli-egerek 90%-a elpusztul. Azoknál a kísérleti egereknél, amelyek túlélték a legyengített mutánsokkal történő „immunizálást”, az LDá0-érték körülbelül 100-szorosának megfelelő vadtörzs-csírákkal történő fertőzés — a mindenkori mutáns fajtájától függően — 4% és 37% közötti elhullást okoz. A nátrium-kloriddal kezelt kontroli-állatok 6%-a pusztul el a megfigyelési idő alatt. — A purin-de pendens Salmonella-mutánsok egéren történő in vivo szaporodása és szövet-perzisztenciája, ami e mutáns-típus nagy itnmunogenitásának előfeltétele (lásd fentebb), a következő kísérletekkel mutatható ki közvetlenül, a Salmonella dublin pur [ade]-16 potenciális oltótörzs segítségével : 18—20 g súlyú ICR -egereknek i. p. 105 mutánscsírát. adtunk be, majd 3 egeret közvetlenül az immunizálás után, további 3—3 egeret pedig 10 napon át naponta leöltünk, steril módon kivettük az állatok lépét és máját, ezeket mozsárban együtt eldörzsöltük és 2—2 ml fiziológiás nátrium-klorid-oldatban szuszpendáltuk. Az így készített töizs-szuszpenziókból fiziológiás nátíium-klorid-oldattal 10-1, 10~2, 10“3.. . logaritritmikus hígítás-sorozatot készítettünk és a 10° . . . 10“4 szuszpenziókból 0,1—0,1 ml-t ágártáptalajra vittünk. 37 °C-on történő 24 órai inkubálás után meghatároztuk a Salmonella kolóniák számát és középértéket képeztünk az adatokból. A kísérlet után a májban és Iépben talált csíraszámok alapján interpolációval kiszámított értékeket az 1. ábrán bemutatott görbével ábrázoltuk. Az ábrán az ordináta a csíraszámok logaritmusát, az abszcissza pedig a napok számát adja meg. Amint a görbe menete mutatja, az állatokban az oltótörzs-csírák száma az első 48 órában csekély mértékben növekszik, körülbelül a 4. napon a növekedés megáll és ezután megkezdődik a Salmonella-mutánsok lassú kiürítése a szövetből. Ezek a kísérleti eredmények megfelelnek azoknak az adatoknak, amelyeket Collins [Bakteriül. Rév. 38, 371—402 (1974)] a szövet-perziszteneiájuk folytán a kísérleti állatokat a specieshez adaptált, nagy mértékben virulens Salmonellák általi letális fertőzéssel szemben megvédő avirulens szerotípusokkal végzett kísérleteiről közölt. — A kísérleti állatokkal végzett laboratóriumi vizsgálatok fenti eredményeit megerősítik a haszonállatokon végzett pre-klinikai és klinikai kísérletek során kapott, elvileg a fentiekkel megegyező eredmények is: 35 szopós malacot háromhetes korban a Salmonella cholerae-suis R ade-4 potenciális oltótörzs 5.108 élő csírájával immunizáltak, majd naponta végbélből sebtörlő gézzel mintát vettek az állatokból és ezeket Stellmacher-Schöll módszere [W. Stellmacher cikke a J. Beer: „Infekíionionskrankheiten d. Hst. ” c. műben, Fischer- Verlag, Jena (1972); Schöll, Forschrittsbei. f. d. Land- und Nahrung sgüterwirtschaft, 16j3, Beilin (1978)] szerint feldolgozták. Az oltótörzs kiválasztását az immunizálás után, szabálytalan sorrendben 35 napon keresztül lehetett kimutatni. 172 sertésen, amelyeket az immunizálás után 26 hétig vizsgáltak Schöll módszerével (i. m., 1978), az oltótöizs kiválasztását az immunizálást követő 38. napig sikerült kimutatni. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait és a lefolytatott kísérletek paramétereit az alábbi példák szemléltetik közelebbről. A) Anyagok és módszerek Vadtörzsek : — Salmonella typhi-murium 415 (Moszkva), i. p. LD5o egéren 10° csíra — Salmonella dublin 81 (Institut für Tierseuchenforschung, Jena) i. p. LD50 egéren: 105 csíra — Salmonella cholerae-suis 431/031 (Dessau), i. p. LD60 egéren: 103 csíra Egyjellemzős mutánsok, mint kiindulási törzsek kétjellemzős oltótörzsek előállítására: — Salmonella typhi-murin his-155 (Lipcse), i. p. LD50 egéren: 106-7 csíra — Salmonella dublin met“91 (Lipcse), i. p. LDM egéren: 106>6 csíra — Salmonella cholerae-suis R 431/256 (Dessau), i. p. LD60 egéren : 105’2 csíra Kísérlet i állatok : 16—18 g súlyú ICR-egerek. Táptalajok a vadtörzsek, a mindenkori egyjellemzős és kétjellemzős mutánsok szaporítására, valamint a mutáns-szelekcióra: Teljes tápközeg: Táp-ágár és táp-húsfőzet (száraz tápközeg) (Staatliches Institut für Immunsere und Nährböden). Minimál-tápközeg : Falkov és munkatársai [J. Bacteriol. 84, 1303— 1312 (1961)] szerinti módosított M9-sóoldat: Davis és Mingioli, [J. Bacteiiol. 60, 17—28 (I960)] szerint, 2,5% vizes ágár és 0,5% dextróz hozzáadásával illetőleg anélkül. A fenti minimál* tápközeget ebben az alakban alkalmazzuk a Salmonella typhi-murium vadtörzs szaporítására; a Salmonella dublin vadtörzs szaporítása esetében még 20 jj.g nikotinsav-amid/ml, illetőleg a Salmonella cholerae-suis vadtörzs szaporítása esetén 20jrg tiamin/ml hozzáadása szükséges. Részben helyettesített minimál-tápközeg : A kiindulási törzs részére minimál-tápközeget használunk 20 gg aminosav/ml hozzáadásával. A Salmonella cholerae-suis R Dessau 431/256 esetében aminosav hozzáadása nélkül alkalmazzuk a minimál-tápközeget; a Salmonella dublin met~91 törzsnél metionin hozzáadásával if ; a Salmonella typhi-murium Ins“ 155 törzs esetében hisztidin hozzáadásával is. Teljesen helyettesített minimál-tápközeg: Mint a fenti részben helyettesített minimál-táp-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 o
