180306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarkozin-oxidáz előállítására
180.306 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,10 ml 3,0 egyséé 0,2 ml 0,5 ml A reakoiókeveréket 37 °C-on 20 percig inkubáltuk., és 2,5 ml etanol hozzáadása után a keveréket k80 mn-nél kolorimetriásan mértük. Amint a 6. ábrán látható, a hidrogénperoxid fejlődése arányos a szarlcozin konoentrációjával. Amint fentebb kifejtettük, a találmány szerinti szarkozinoxidáz enzim katalizálja azt az oxidációs reakciót, amelyben a szarkozin mólonként egy mól vizet fogyasztva oxigénnel reagál, miközben glioin, formaldehid és hidrogénperoxid keletkezik. Ezért ezt az enzimet EC 1.5.3,1 szarkozin: oxigén oxidoreduktáz /demetilező/ enzimként határozzuk meg. A szarkozin oxidázt enzimes diagnosztikai reagensként, például vérben és vizeletben a kreatinin meghatározására lehet kreatináz és kreatinináz meghatározásával kombináltan használni. A szarkozin-oxidázzal továbbá a kreatinináz aktivitása is meghatározható. A következő példa a találmány szerinti eljárást szemlélteti. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. 1. példa 0,5 % kreatint, 0,5 % oldható halkivonatot, 0,2 $ élesztőkivonatot, 0,3 % káliumkloridot, 0,1 % kálium-hidrogénfoszfátot és 0,05 % kristályos magnéziumszulfátot tartalmazó 100 ml folyékony táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 120°-on 20 percig sterilizálunk, majd Bacillus sp. B-06l8 FERM-P 40^9 mikroorganizmussal beoltjuk, és egy napig 30 °-on inkubáljuk. Ezt az oltótenyószetet 30 literes fermentáló kádban levő, 20 liter ugyanilyen összetételű sterilizált folyékony táptalajhoz adjuk hozzá, és percenként 200 fordulattal keverve, percenként 20 liter levegővel levegőztetve, 30 °C-on 20 óra hosszat tenyésztjük. Á centrifugálással elválasztott baktériumáéjttömeget 7,0 pH-jú, 10 mmólos foszfátpufferre1 mossuk, ugyanilyen pufferoldatban szuszpendáljuk. majd lizozimet adunk hozzá (végső koncentrációja 0,2 mg/ml), és 37 °-on 30 peroig keverjük. A keveréket 15 peroig peroenként 5000 fordulattal centrifugáljuk, és a felülúszó folyadékot leöntjük (szarkozinoxidáz aktivitása 1*100 egység). Az igy kapott felülúszó folyadékhoz 2,5 ml, 2 %-os protaminszulfát oldatot adunk, és a nukleinsav csapadékot eltávolítjuk, A felülúszó folyadékhoz telitett ammóniumszulfát oldatot adunk, és az 50-70 % ammóniumszulfát koncentrációjú frakciók csapadékát elkülönítjük. A csapadékot 20 ml 8,0 pH-jú 10 mmólos trisz-HCl pufferban feloldjuk, és 3,5 x 3° cm méretű oszlopon levő Sephadex G-25 gyantán átszűrve, sómentesitjük. A sómentesitett oldatból 10 mmól, 7,0 píl-jú trisz-HCl puff errai pufferőit 2,0 x 30 cm méretű DEA E-oellulóz oszlopon az enzimet adszorbeáljuk, 0,1 mól káliumkloridot tartalmazó trisz- HCl pufferoldattal mossuk, és 0,1 mól - 0,5 mól grádiensü káliumlclorid oldattal eluáljuk. Beakolókeverék: 0,2 mólos, o,0 píl-jú trisz-HCl pufferoldat 3 uig/ml-os ^-amino-antipirin 0,2 %—os fenol 0,5 mg/inl-es peroxidáz alikvot koncentrációjú szarkozin szarkozin-oxidáz desztillált viz
