180285. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különböző poliszacharidéterek új aminoszármazékainak előállítására affinitáskromatográfia kárkészítés céljából
180.285 7.2. A receptor tisztítása. 7-2.1. A ci tőszói készítése: 150-200 g-or him V,'istar patkányok mellékveséit kiirtjuk 5-10 nappal a felhasználás előtt. Az altatott patkányok májait periundaltatjuk a portálig vénán keresztül 20 ml fiziológiás sóoldattal és 20 ml homogenizáló pufferrel. Ezután kimetsszük őket, megmérjük a súlyúkat, ollóval megvagdossuk és teflon-üveg Potter-Elvahjem homogenizálóval homogenizáljuk kút térfogat 50 ihl.i í.'.fo-t /pH 6.5/» 5Ó mit KF-ot, 1 mil EDTA-t és 1 nM ditlotreitolt tartalmazó pufferben. A homogenizátumot 4000 g-n 10 percig centrifugáljuk, majd a felúszó lipid réteget óvatosan eltávolít— jukr a felülúszót ultracentrifugán 105 000 g-vel 1 órát centrifugaijuk, hogy megkapjuk a citos •.ólt. 7.2.2. Az affinitáskrómatográfia leírása: 2 ml gélt 5 ml patkány májc 2 órán át O^C-on óvatosan keverűn unzót a félről leöntjük és mérjük a fehérjetartalmat. A gélt hat ;s itoszóllal / 100 mg fehérje/ k. Centiífugálás után a felüla visszamaradó receptor kötést, szór mossuk, egyenként 10 ml 3 it olt teszünk. Ez legfeljebb gélre 2 ml /redukáloszerrel cinolon acetonidot /21 Ci/mmól/ tartalmazó B pufiért öntünk és 20 órán át 0°C-on inkubáljuk. Ezkendőbe töltjük, melynek kifopufferrel, melybe 0,5 mM ditiotre: 50 percet vehet igénybe. A mosott kiegészített/ 2 /ul.í-os /5n/-triam< 4" cs r> ■ft mi 1 n rr Á T5 r\n Sr a V» 4- owf-íin !/ An O f\ után az elegyet egy plasztik fees lyóját egy porózus teflon lemezzel zártuk le, és 1000 g-n lecentrifugálj k a felüluszót. A gél az előbbi módon. Az egyesitett fe kötést é3 a fehérjetartalmat. Ezé tisztítható a glükokortikoíd rece képest /4. táblázat/. t 1 ml B pufferrel utánamossuk lüluszóban mérjük a specifikus n eljárással 100-120-szorosra ptor a kiindulási citoezólhos 8. példa Enzim immobilizációs kísérletek: Az 1. példában leirt amino terminális csoportokat tartalmazó gélt 0,1 1.1-os, pH 8,5-ös foszfátnufferben szuszpendáljuk, és az aminocsoportokhoz tízszeres moláris feleslegben állandó kevertetés mellett borostyánkősavanhidridet adunk, és 1/2 órát szobahői;okon reagáltakjuk vele. A kész karboxil terminális csoportokat tartalmazó mátrixot desztillált vízzel semlegesre mossuk. Ezen kívül 0-brómacetil-lT-hidroxiszukcinlmiddel elkészítjük a kiinduló gél brómacetilezett származékát is /P.Cuatrecasas /1970/ J.Biol.Chem. 245, 5059-5065/. Ez utóbbin, valamint a primer amino-, ill. karboxil funkciós csoporttal rendelkező származékokon megfelelő aktiválás után fehérjék /pl. enzimek, antitestek/ immobilizálhatók. A fenti származékok eredményes alkalmazásának példái a sertés vese aminoaciláz es a marha pankreász karboxípeptidáz A imnobilizálása az alábbiak szerint: Az O-brómacetil-N-hidroxiszukcinimiddel kialakított brómacetil származékot pH 8,5-os foszfátpufferben szuszpendáljuk. Ehhez a szuszpenzióhoz adjuk az aminoaciláz oldatát, majd megfelelő ideig tartó kevertetés után a szuszpenziót leszivatjuk és ismételt mosásokkal eltávolítjuk az elreagálatlan fehérjét. A visszamaradt, immobilizált aminoaciláz aktivitása: 3750 /urnól N-acetil-L-metionin hidrolizise/óra/g immobilizált enzim. 7
