180053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiai minták tejsav-tartalmának meghatározására fotometriás úton
5 180053 6 sztöchiometrikus összetételű. A komplex sztöchiometrikus összetétele lehetőséget ad arra, hogy a réz(II)-ionok meghatározására ismert módszert aldehidek — köztük a tej savból képezett acetaldehid — mennyiségének kvantitatív meghatározására alkalmazzuk. Ebben az esetben a következőképpen járunk el: Az oxidált biológiai mintához a bevitt cérium(IV)-ionokkal legalább egyenértékű menynyiségű trinátrium-citrátot és a meghatározandó acetaldehid mennyiségével legalább egyenértékű réz(II)-sót (célszerűen réz(II)-szulfátot) adunk, a kapott elegy pH-ját trietanol-aminnal vagy dietanol-aminnal 8 és 9 közötti értékre állítjuk be, és ezután vagy ezzel egyidőben az elegyhez legalább a meghatározandó acetaldehiddel egyenértékű mennyiségű oxalil-dihidrazidot adunk. Az elegyet a színreakció kifejlődéséig (rendszerint kb. 30 percig) állni hagyjuk, majd meghatározzuk az elegy extinkcióját, és a biológiai mintával azonosan kezelt, ismert tej sav-tartalmú standard minta felhasználásával kiszámítjuk a biológiai minta tejsav-tartalmát. Az acetaldehidből, oxalil-dihidrazidból és réz(II)-ionokból kialakult, sztöchiometrikus öszszetételű, élénk kék színű komplex színintenzitása egyenesen arányos az acetaldehid mennyiségével, az acetaldehid mennyisége viszont egyenértékű a biológiai minta tejsav-tartalmával. A meghatározás pontosságának fokozása és a véletlen szennyezések hatásának kiküszöbölése érdekében mind a standard minta, mind pedig a biológiai minta extinkcióját célszerűen a mintákkal azonosan kezelt, azonban tejsavat nem tartalmazó ún. vakmintával szemben olvassuk le. A trinátrium-citrátot és a réz(II)-sót — célszerűen réz(II)-szulfátot — előnyösen egy közös reagens-oldat formájában adjuk a kénsavas cérium(IV)-szulfáttal kezelt mintához. A trinátrium-citrát egyrészt elbontja az oxidálószer fölöslegét, másrészt stabil komplexben köti az öszszes jelenlevő Ce(IV) és Ce(III) iont. Egyúttal a trinátrium-citrát a savas elegy pH-jának tompítására is szolgál. A trinátrium-citrátot és réz(II)-sót — célszerűen réz(II)-szulfátot — tartalmazó oldat hosszabb állás közben gombásodik; ezért az oldatot vagy frissen kell készíteni, vagy az oldathoz gombaölő szert kell adni. Gombaölő szerként különösen előnyösen alkalmazhatunk nátriumazidot, mert ez a vegyület a meghatározás körülményei között nitrogénre és nátriumhidroxidra bomlik, így nem képez a meghatározást zavaró bomlástermékeket. A trietanolamint vagy dietanolamint és az oxalil-dihidrazidot előnyösen frissen készített, közös, desztillált vizes reagens-oldat formájában adjuk a réz(II)-sót tartalmazó mintához. A felhasznált alkanolamin a réz(II)-ionokkal laza (az oxalil-dihidrazid/acetaldehid/réz(II) komplexénél lényegesen kisebb stabilitási állandójú) komplexet képez, és közvetítő hatása révén elősegíti a háromkomponensű komplex kialakulását. Ugyanakkor az alkanolamin a színreakció optimális kialakulásához szükséges, 8 és 9 közötti pH-értéket biztosítja. Annak érdekében, hogy a színreakció viszonylag rövid idő (kb. 30 perc) alatt kialakuljon, a komplexképző reagenseket (réz(II)-sót, oxalil-dihidrazidot) tartalmazó oldatokat legalább szobahőmérsékleten (20—25 °C-on) kell a mintához adnunk. A színreakció kialakulásának meggyorsítására a mintát enyhén (legföljebb kb. 37 °C-ra) melegíthetjük. A fent ismertetett eljárás — amely aldehidek meghatározására általánosan alkalmazható — különös előnye a rendkívül nagy érzékenység. Ezzel az eljárással már 50 mikroliter vérből is pontosan meghatározhatjuk a tej sav-tartalmat, szemben az egyéb fotometriás módszerekkel, amelyek rendszerint 1,0—2,0 ml vért igényelnek. Üj módszerünk tehát különösen előnyösen alkalmazható olyan esetekben, amikor csecsemők vagy anémiás egyének vérének tejsav-tartalmát kell viszonylag sűrű időközönként meghatározni. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában részletesen ismertetjük. Példa Ebben a példában vér, illetve liquor tej savtartalmának meghatározását közöljük. A következő reagens-oldatokat használjuk fel: 1. Perki ársáv a. lt. 0,6 mól/1 2. Cérium(IV)-ammónium-szulfát a. lt. 0,5 mól/l-es kénsavoldatban oldva 0,1 mól/l 3. Trinátrium-citrát 5,5 H2O a. lt. 0,1 mól/1 kristályos réz(II)-szulfát 5 HoO a. lt. 0,005 mól/1 nátriumazid a. lt. 0,01 mól/1 desztillált vízben oldva 4. Trietanolamin a. lt. 3,0 mól/'l desztillált vízzel hígíva 5. Oxakl-dihidrazid a. lt. 0,02 mól/1 desztillált vízben oldva 6. Standard: litium-laktát a. lt 0,005 mól/1 nátriumazid a. lt. 0,01 mól/1 desztillált vízben oldva. A minták és a reagensek felhasznált mennyiségét az 1. táblázatban foglaljuk össze. A tökéletes fehérjementesítés érdekében a fehérjék eltávolításához jéghideg perklórsav-oldatot használunk fel. A perklórsav-oldat beadagolása után 4—5 percig várunk, majd a kezelt mintát centrifugáljuk. A felül úszóból ismert térfogatú mintát veszünk, és hozzáadjuk a 2. sz. oldatot. 10 perces várakozás után a kapott elegyhez hozzáadjuk a 3. sz. oldatot. Annak érdekében, hogy a színreakció megfelelő sebességgel menjen végbe, a mintákhoz legalább szobahőmérsékletű (20—25 °C-os) 3. sz. oldatot adunk. A kapott elegyet a teljes elszíntelenedésig alaposan összerázzuk, majd 9 térfogatrész 4. sz. oldat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
