180021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 20 alfa-hidroxi-metil-pregna-1,4-dién-3-on, 20 alfa-hidroxi-metil-pregn 4-én-3-on vagy ezek elegyének előállítására
9 180021 10 HPD-t és/vrgy a 4HP-t legalább 50, általában legalább 70 mólszázalékos kitermeléssel kapjuk, a felhasznált szterin mennyiségéhez viszonyítva. Ezen túlmenően annyiból is gazdaságilag előnyös a találmány szerinti eljárás, hogy a szubsztrátum nagy koncentrációja (pl. 1—4%) melletti inkubálás esetén a HPD és/vagy 4HP kitermelése emelkedik. Találmányunkat részletesebben néhány példával ismertetjük, melyekre azonban találmányunk nem korlátozódik. Az alábbi példákban adott elemzéseket a szterinek, azok származékai, a HPD, a 4HP, a visszamaradt szterinek és a melléktermék szteroidok tekintetében gázkromatográfiával végeztük. A példákban adott százalékok — ha nincs eltérő dimenzió feltüntetve — súlyszázalékok. 1. példa 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó részben vizet tartalmazó oltóanyag tápközeget (pH 7,2) készítünk. Ebből az oltóanyag tápközegből 100 ml mennyiséget töltünk 500 ml űrtartalmú rázólombikba. A lombikot és annak tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A közeget oltókacsnyi mennyiségű Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 tenyészettel inokuláljuk, majd az inokulált közeget 72 órán át 30 °C hőmérsékleten vibrációs rázógépen rázzuk, percenként 120 — 7 cm kitérésű — iökettel. Tíz (10) 500 ml űrtartalmú rázólombik mindegyikébe 50 ml főfermentációs tápközeget töltünk, melynek összetétele : 4% szójababolajos liszt 2% halolaj gyártási melléktermék 0,2% K2HP04 0,2% NaN03 0,1% MgS04- 7 H20 1,0% koleszterin A lombikokat és tartalmukat autoklávban 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Mindegyik lombikot inokuláljuk a fentiek szerint kapott oltóanyag tápközeg 2 ml-nyí mennyiségével. A fő fermentációt 30 °C hőmérsékleten kezdjük vibrációs rázógépen, percenként 120 — 7 cm kitérésű — Iökettel, Az inkubálás kezdetétől számított 160 óra után az inkubálást befejezzük. A kombinált fermentációs táptalajt kétszer extraháljuk 2 1 etil-acetáttal. A kombinált extraktumból az oldhatatlan anyagokat, pl. sejteket kiszűrjük; az extraktum szteroid tartalma az elemzés tanúsága szerint: 0,05 g visszamaradt koleszterin szubsztrátum, 2,65 g HPD és 0,22 g 4HP. ïf Eszerint a HPD és a 4HP kitermelése — a felhasznált szterinhez viszonyítva — 85%-os. A melléktermékek között van 0,03 g ADD. Az extraktumot szilikagélen kromatografáljuk, majd 20%-os etil-acetát-n-hexánnal eluáljuk, így elkülönítjük a HPD-t, a 4HP-t és a visszamaradt szubsztrátumot és a melléktermékeket. A HPD, illetve 4HP frakciók mindegyikét dúsítjuk, majd tisztítjuk az oldószer bepárlásával, ezután kétszer átkristályosítjuk 10%-os etanol-heptánból, így nyerünk tiszta kristályos alakban 2,45 g HPD-t és 0,17 g 4HP-t. Olvadáspontjuk, tömegspektrogramjuk, NMR és IR számuk megegyezik az irodalomban található értékekkel. 2. példa Megismételjük az 1. példát azzal az eltéréssel, hogy az E táblázatban szereplő különböző szterineket alkalmazzuk kiindulási szterinekként koleszterin helyett. 1. táblázat Termék (g) HPD 4ÍIP maradék szubsztrátum p-szitoszterin +kampeszterin (2 : 1 elegy) 1,88 0,12 0,67 koleszt-4-én-3-on 1,33 0,08 1,48 k oleszta -1,4-d ién-3-on 2,13 0,02 0,85 koleszteril-olcát 0,29 0,03 3,10 3. példa Megismételjük az 1. példát azzal az eltéréssel, hogy a következő összetételű vizes fő fermentációs tápközeget alkalmazzuk: 6% őrölt szójabab 1% élesztő 0,25% K2HP04 0,1% MgS04.7 H20 valamint koleszterin a 2. táblázat szerinti koncentrációban. Az elemzés eredményét a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat Koleszterin koncentráció (súlyszázalék) HPD (g) 4HP (8) Maradék koleszterin (g) 0,2 0,68 0,06 0,0 0,5 1,35 0,10 0,0 0,8 2,57 0,13 0,15 1,0 2,81 0,18 0,40 4. példa Az 1. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy 5 1 űrtartalmú rázólombikba töltünk 800 ml tápközeget, mely tartalmaz 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont, 0,5% Tween—80 felületaktív anyagot (a Kao Atlas Co., Ltd. védjegye), 1,0% koleszterint és a fennmaradó részben vizet; továbbá, hogy a fő fermentációt 30 °C-on végezzük vibrációs rázógépen, percenként 100 — 7 cm kitérésű — Iökettel, 150 órán át, miután a lombikot az oltóanyag tápközeg 20 ml-nyi mennyiségével inokuláltuk. A kapott etil-acetát extraktum elemzése kimutatja 0,90 g HPD és 0,76 g 4HP jelenlétét. Az átalakulatlan koleszterin-maradék mennyisége 4,8 g. 5. példa A következő összetételű oltóanyag tápközeget készítjük : 1,0% glükóz 1,0% húskivonat a fenn-1.0% pepton maradó rész víz 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
