179995. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a légzőszerven keresztűl beadható vakcina és késztmény előállítására
9 179995 10 rek tápanyagót is tartalmazhatnák. A mélyhűtés elleni védő-stabilizálószerek a baktériumsejtek tápanyagaként dextráht, zselatint, tejcukrot, nátriumglukamátöt, marha-albumint, feltárt kazeint, glukationt és foszfátsókat, például káliüm-hidrogénfoszfátot vagy káliüm-dihidrogértfoszfátot tartalmazhatnak. A következő példák a vakcinák előállítását és a használatukkal elért eredményeket szemléltetik. A hőmérsékleti adátokat Celsius-fokban adjuk meg. 1. példa Bordetella bronchiseptica 55. törzset (ATCC 31437) triptóz-foszfát folyékony táptalajon 24 óra hosszat 37°-on tehyésztünk. A tenyésztés időtartama alatt a baktériümtèrtyészetèt mágneses keverővei vagy steril levegő bevezetésével keverjük. Amikor à sejtsürűség eléri a ml-ehként 2 • 108 sejtet, alkalmassá válik a begyűjtésre. Ekkor a tenyészetbe Mélyhűtés elleni védő-stabilizálószert, például oldhatóvá tett kázein-téjcukor készítményt, déxtráh-cukor készítményt, glicerint vagy szérUM-cükor készítményt adunk. Ebben á kísérletben steril, íonmentesltett vizet hászhálva 3 alkotórészes készítményt állítunk elő a következőképpen: I. oldat gramm/liter N-Z amin AS 150,0 dextrán 60,0 zselatin 4,0 II. oldat tejcukor 200,0 nátfium-glukarhát 4,0 kálium-hidrogénfoszfát 2,12 dikálium-hidrogénfoszfát 5,0 marha-albumin V frakció 20,0 III. oldat glütation 50,0 Az I. oldatban használt N-Z amin AS pánkreásszal feltárt kazein; vízben víztiszta oldatot alkót. Beszerezhető a Sheffield Chemical, Norwich, New York cégtől. A II. oldatban használt marha-albumin V frakció marha-plazmából készül és vízben vegyileg oldódik. Beszerezhető a Milés Reséöréh Products, Miles Laboratory Inc., Elkhart, Indiana cégtől. Az I. oldatot autoklávban és a II. és III. oldatokat steril szűréssel sterilizáljuk. Az oldatokat a következő arányban adjuk hozzá az 55. törzs sejttehyészetéhez : Térfogat (ml) 55. töfZS tenyészet (2 • Í08 sejt/ml) 6000 I. oldat 1500 II. oldat 1500 III. oldat 29,7 A vakcinát 2 ml töltőtérfogatú (1,8—2,2 ml vakcinatérfogat határ) steril vakcinafiolákba töltjük, — 50°-ra hűtjük, majd ipari liofilizálóval szárítjuk. A szárítás után az életképes sejtek száma körülbelül 2 • 106/ml, így mindegyik fiola körülbelül 4,0 ■ 106 sejtet tartalmaz. Az I., II. és III. oldatok hozzáadása által a sejtszuszpenzió 2 ■ 108-ról 1 ■ l08/ml-re hígul. A szárítás miatt az életképes sejtek száma 1,3 • 108-ról 2 • 106-ra csökken. A másik sorozat fiolát Triton X 100 (a Signian Chemical Company, St. Louis, missouri cég) nem-ionos nedvesítőszert (oktil-fenoxi-polietoxietanolt) tartalmazó steril ionmentesített vízzel töltünk rrieg. Mindegyik fiolába a nem-ionos nedvesítőszert tartalmazó, steril víz 1 ml-ét töltjük. A sertéseknek vagy kutyáknak légzőszervén keresztüli beadásra használt vakcina előállítására a két fiola tartalmát egyesítjük úgy, hogy 1 ml steril vizet adunk a fagyasztva szárított sejtek egyszeri adagjához (4 • 106 sejt), és így körülbelül 1 ml térfogatú és 4 • 106 sejt/ml koncentrációjú vizes szuszpenziót kapunk. Ezután az újra szuszpendált vakcina adagót intranazálisan adjuk be kutyáknak oly módon, hogy mindegyik orrlyukba fecskendővel vagy porlasztóval 0,5 rhl-t viszünk be vagy másképpen a kutyákba a garat felső részébe aeroszolos porlasztás segítségével 1 ml szuszpenziót juttatunk. 2. példa Az 55. törzs vakcináját az 1. példa szerint állítottuk elő,és az ott közölt módon újra szuszpendáltuk. A szuszpendált vakcinát kutyákba beadva vizsgáltuk. A kísérletben 10 olyan kutyát használtunk, amelyek mentesek voltak a Bordetellá bronchiseptica fertőzéstől és ez elleh nem lettek immunizálva. A kutyákat 2 csoportbá osztottuk; mindegyik csoportban 5 kutya volt. A kontroll állatokat (I. csoport) elkülönítetten tartottuk és a kezelendő csoportot (II. csoport) immunizáltuk. A frissen újra szuszpendált vakcinát erőteljesen ráztuk, hogy a szárított vakcina-pasztilla tökéletes oldódásáról és szuszpehdálásáról megbizonyosodjunk. A II. csoportbeli 5 kutya mindegyikének mindkét Orrlyukát örrbévezetővel ellátott fecskendő segítségével 0,5 ml újraszuszpendált vakcinával beoltottuk. A kutyáknák ezáltál orrlyukanként az 55. törzs körülbelül 2 • 106 életképes sejtjét adtuk be. A II. csoport immunizálását követő 14. napon mindkét csoportbeli összes kutyát Bordetella brönchoseptica virulens törzsével fertőztük. A fertőző tenyészet ml-enként körülbelül 2 ■ 108 sejtet tartalmazott. Mindegyik kutya orrát 0,03 m3-és műanyag dobozba helyeztük és 2,5 percre virulens Bordetella bronchisepticával télített levégő hátásának tettük ki. Ezután mind a tíz kutyát ugyanabban áz ólban tartottük. A következőkben minden kutyát naponta megfigyeltük a légcső-hörghurutos köhögés klinikai tünetei szempontjából és hetenként kétszer 40 napon át mindegyik kutya brrát utólagosan kenettel is fertőztük. A II. csoportbeli — azaz az immunizált — kutyák egyike sem mutatta a légcső-hörghurutos köhögés bármilyen klinikai tünetét, míg az I. csoport (kontroll kutyák) állatai közül kettő ilyen klinikai tüneteket mutatott. Az I. csoport kutyáival összehasonlítva a II. csoportbeli kutyáknál jelentősen nagy volt az ellenállás a virulens Bordetella bronchiseptica fertőzéssel szemben. Hogy milyen mértékben maradtak meg az 55. törzs sejtjei a fertőzött II. csoport kutyáinak orrlyukaiban, vizsgálatainkban megkülönböztettük ezeket a virulens fertőző törzstől. Az orrkeneteket tenyésztettük és a virulens fertőző sejteket telepet kialakító egységekként kifejezve megszámláltuk. Az eredményeket az A) táblázat tartalmazza. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
