179965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására
11 179965 12 klorid-oldatban. Az oldódást 1 óra hosszat tartó és 25 C°-on való keveréssel elősegítjük, majd az oldatot szűrjük. A szűrlethez hozzáadunk 550 liter vizet és annyi 3 n vizes hidrogénklorid-oldatot, hogy a pH-ja 2,1 legyen. Az oldat végső térfogata 800 liter. B) Rost képzés Az így kapott oldathoz hozzáadunk 3,2 liter 0,1 mólos EDTA oldatot és 4,8 liter 50 súly%-os vizes ammóniumszulfát-oldatot. A keletkező oldat pH-ja 2,3. A rostképződés elősegítése érdekében az oldatot 48 óra hosszat 27 C°-on keverjük. A rostokat centrifugálással elkülönítjük a felülúszó folyadéktól. A rostokat 120 liter 2,0-es pH-jú vizes hidrogénklorid-oldatban szuszpendáljuk, amely még 0,2 százalék (súly/térfogat) fenolt is tartalmaz. Az oldat pH-ját 10 százalékos vizes káliumhidroxid-oldattal 10-es értékre állítjuk be. Az oldat végső térfogata 122 liter, összes szilárdanyag-tartalma 683,2 g, amely 5,6 mg/ml-nek felel meg. Az oldat 98,088g glukagont tartalmaz, amely 804 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság 14,36 százalék, a kitermelés pedig 68,12 százalék. C) Közbenső kristályosítás A glukagon-rost oldatának pH-ját 10%-os vizes foszforsavval 7,0-re állítjuk. Az oldatot 60 C°-on melegítjük és ezalatt az idő alatt annyi vizet adunk hozzá, hogy a térfogata 137 liter, szilárdanyag-koncentrációja pedig 5.0 mg/ml legyen. Az oldat pH-ját ezután 10%-os vizes foszforsav-oldattal 5,0-re állítjuk és az oldatot melegen szűrjük. A szűrletet 72 óra hosszat 5 C°-on tartjuk. Az anyalúgot dekantálással és centrifugálással elválasztjuk és felhasználásra félretesszük. A kristályos glukagont 9,5-es pH-jú és 9,0 liter mennyiségű vizes ammóniumhidroxid-oldatban oldjuk és a keletkező oldatot szűrjük. Az oldatból 1 liter mennyiséget a 3. példánál való felhasználásra elveszünk. Ez a mennyiség 11,1 százaléka az oldatnak. Az egész 9 liter glukagon-oldat 99.0 g összes szilárdanyagot tartalmaz, amely 11,0 mg/ml-nek felel meg. Ez az oldat 42,11 gramm glukagont is tartalmaz, amely 4,679 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság 42,54 százalék és a kitermelés 29,24 százalék. D) Gél-szűrés A visszamaradó 8 liter glukagon-oldatot rávisszük egy a 2DJ példában leírt ötszelvényes oszlopra. Áz anyagot a már leírt módon 350—500 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluálás az előzőekben leírt módon megy végbe. A glukagon-tartalmú eluátum-frakció 30 liter és ez 66,0 g összes szilárdanyagot tartalmaz, amely 2,2 mg/ml-nek felel meg. A glukagon-tartalom 36,84 g, amely 1,228 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság 55,8 százalék és a kitermelés (figyelembe véve az elvételt) 28,78 százalék. E) Végső glukagon-kristályosítás A glukagon-tartalmú eluálási frakció pH-ját 0,1 liter 10%-os vizes foszforsav-oldattal 7,5-re állítjuk be. Az oldatot 16 óra hosszat 5 C°-on keverjük a glukagonkristályosodás elősegítése érdekében és a képződött kristályokat 72 óra hosszat ülepedni hagyjuk. Az anyalúgot dekantálással és centrifugálással elkülönítjük és felhasználás céljából félretesszük. A glukagon-kristályokat egymásután 0,001 %-os sóoldattal, vízmentes alkohollal és éterrel mossuk, utána pedig vákuumban szárítjuk. Az így kapott glukagon-kristályok mennyisége 33,654 g. A glukagon-tisztaságot aminosav-analízissel és kationcserélő kromatográfiás analízissel határozzuk meg. A tisztaság 84,35 százalék. Az összes tiszta glukagon mennyisége 28,39 g, 22,17 százalékos kitermelésnek felel meg. 3. példa Egy liter 2C) példa szerint készített glukagonrostoldat pH-ját gyengén nedves körülmények között 7,8-ra állítjuk körülbelül 300 ml 10%-os vizes foszforsav-oldattal. Az oldatot ezután 2 óra hosszat 25 C°-on keverjük, amelyet 16 órás keverés követ 5 C°-on. A képződött glukagon-kristályokat 72 óra alatt hagyjuk ülepedni. Az anyalúgot centrifugálással elkülönítjük és újból felhasználjuk. A kristályos glukagont egymásután mossuk sóoldattal, vízmentes alkohollal és éterrel, majd vákuumban szárítjuk. Az így kapott glukagon mennyisége 3,897 g. A glukagon-tisztaság aminosav-analízissel és kationcserélő kromatográfiás analízissel meghatározva 81,5 százalék. így a glukagon-kitermelés 3,341 g vagy 21,09 százalék. Ezekből a példákból kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással nagyobb tisztaságban és nagyobb kitermeléssel lehet előállítani glukagont, mint a legelőnyösebb eddig ismert eljárással még akkor is, ha ezeket az eljárásokat a gél-szűrési lépéssel kombináljuk. A találmány szerinti eljárás, amelyet az 1. példában részletesen bemutatunk, jobb megértése végett a csatolt rajzra hivatkozunk. A rajz egy eluálási diagram, amely jellemző az 1. példában levő gél-szűrési lépésekre. A rajz különböző frakciók abszorpciós képe 280 nm-nél a távozó folyadéktérfogathoz viszonyítva és a kiválasztott frakciók glukagon-tartalmának képe a távozó folyadéktérfogathoz (literben mérve) viszonyítva. így a diagram az eluálás során távozó és összegyűjtött folyadéknak mint a protein-tartalmát, mind a glukagon-tartalmát mutatja. A diagramból jól látható, hogy a glukagon viszonylag éles sávban eluálható, míg a proteinek folyamatosan haladnak át az oszlopon. A leírásból látható, hogy az egyes tisztítatlan glukagonra vonatkozó tisztítási körülmények könnyen meghatározhatók. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására, azzal jellemezve, hogy száraz állapotban legalább 4 súly% vizet tartalmazó és 100 mikronnál kisebb részecskeátmérőjű gélt duzzasztunk, a duzzasztott gélt kromatográfiás oszlopba töltjük, a töltött oszlopra 9— 11 pH-jú, legalább 0,1 százalék glukagont tartalmazó vizes glukagon-oldatot adunk, amelynek 10 súly%-nál kevesebb az összes protein-tartalma a szilárd proteinre vonatkoztatva és az oszlopra vitt glukagon összes menynyisége olyan nagyságú, hogy 0,01—5 g/liter ágytérfogat oszlopterhelést ad, majd a glukagont 4 C° és 40 C° 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
