179965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására
7 179965 8 Az oszlop eluálását 4 C -tól 40 C°-ig terjedő hőmérséklettartományban végezzük. Ezt a folyamatot előnyösen azonban környezeti hőmérsékleten vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten hajtjuk végre. Az eluálási folyamatot bármilyen alkalmas módon követhetjük. Egy gyakorlatilag használható módszer abban áll, hogy mérjük az egyes frakciók ultraibolya abszorpcióját 280 nm-nél. Azokat a frakciókat, amelyek a kívánt tisztított glukagont képviselik, egyesítjük és nagy tisztaságú glukagon kristályok készítése érdekében tovább tisztítjuk. Általában a további tisztítási folyamatok megválasztása az eluátumban levő glukagon tisztaságától és koncentrációjától függ. A megfelelő módszert a szakember könnyen megállapíthatja. Szokás szerint közvetlenül kikristályosodik az eluátumból, ha az eluált glukagon tisztasága nagyobb 10 százaléknál (súly/súly, az oldat összes szilárdanyag-mennyiségére vonatkoztatva) és a glukagon-koncentráció az eluálószerben nagyobb, mint 300 mcg/ml eluálószer. A glukagon rendszerint közvetlenül kikristályosodik az eluálószerből savas pH-nál, például 4,8—5,2 pH-nál, előnyösen pedig 5,0 pH-nál. A glukagon egy másik ilyen közvetlen kikristályosítása a cink segítségével történő kristályosítás. Abban az esetben, ha a glukagont tartalmazó eluátum glukagontartalma 10%-nál kevesebb, az eluálószerből a glukagont elkülöníthetjük 20%-os sóval történő kicsapással is és a kicsapott glukagont ezután savas körülmények között átkristályosítjuk. Kívánt esetben egy második gél-szűrést végezhetünk az átkristályosítás előtt. Az így kapott glukagon mindegyik esetben közbenső tisztasági fokkal rendelkezik és további tisztítást igényel. Ilyen további tisztításnál az átkristályosítást gyengén alkalikus közegből, például 7—8 pH-nál, vagy ioncserélő kromatográfiával végezzük, de mindkettőt is alkalmazhatjuk. Egy különösen előnyös módszer szerint úgy járunk el, hogy a részben tisztított kristályos glukagont újból feloldjuk és a keletkező glukagon-oldattal egy második gél-szűrést végzünk a találmány szerinti eljárásnak megfelelően, ezt követően pedig a glukagont savas vagy gyengén alkalikus körülmények között kikristályosítjuk az eluálószerből. Ily módon 90%-osnál nagyobb tisztaságú glukagont állíthatunk elő. Ilyen előnyös módszert a későbbiekben részletesebben is leírunk. Általában 2—5 súly% tisztaságú glukagont alkalmazunk a nagybani tisztításnál a találmány szerinti eljárás során. Az ilyen tisztaságú glukagon szokásosan a szarvasmarha és a sertés hasnyálmirigyekből származó inzulin nagybani elkülönítésekor és tisztításakor kapott hasnyálmirigyes protein-frakciókból áll, amelyeket a következőkben általában glukagonforrásként alkalmas proteinnek nevezünk. A tisztítatlan glukagont, például a glukagonforrásként alkalmas proteint, körülbelül 3-as pH-jú savas vízben oldjuk, amelyből az alkalmazott oszlop ágytérfogatának körülbelül 10%-nyi mennyiségével egyező mennyiséget használunk. Az oszlopra viendő keletkező glukagonoldat körülbelül 3—4 g szilárd anyagot tartalmaz 1 liter ágytérfogatra számítva, a glukagontartalma pedig 0,06—0,2 gramm ágytérfogat-literenként. Az oszlopot 9,0—10,5 pH-jú 0,001 mól EDTA-t és 0,1 tf.% butanolt tartalmazó híg, vizes ammóniumhidroxid-oldattal egyenlítjük ki 25 C°-on. A legelőnyösebb gél a Sephadex G—50F. Az oszlopra viendő glukagon-oldat pH-ját híg, vizes bázissal vagy szerves pufferrel 9—11 értékre állítjuk be. Kívánt esetben ilyen oldatnak az oszlopra való vitele előtt az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolíthatjuk belőle. A glukagon-oldatot ezután az oszlopra visszük és 9,5 pH-jú vizes ammóniumhidroxid (EDTA) butanololdattal a fent leírt módon eluáljuk. A glukagon körülbelül 0,78—0,82 Kd értéknél jön le olyan eluálószertérfogatban, amely az ágytérfogatnak körülbelül 20— 25 százaléka. A glukagon-koncentráció a glukagont tartalmazó eluálószerben előnyösen 400—700 mcg/ml. Az ilyen glukagon tisztasága 10 százaléknál nagyobb. Abban az esetben, ha a további felhasználást későbbre halászijuk, a glukagont tartalmazó eluálószert híg hidrogénklorid-oldattal körülbelül 3-as pH-ra savanyítjuk. A glukagon-tartalmú eluálószer előtti frakciókat (előfrakciók) és utáni frakciókat (utófrakciók) elkülönítjük és visszakeringtetjük a folyamatba további glukagon kinyerése érdekében. További feldolgozásra a glukagont tartalmazó eluálószert híg foszforsavval, vagy híg, vizes nátrium- vagy káliumhidroxid-oldattal 5-ös pH eléréséig kezeljük. Az oldatot ezután körülbelül 60 C°-ra melegítjük és szűrjük. Ezt követően a szűrletet körülbelül 5 C°-ra hűtjük és ekkor megindul a glukagon kristályosodása. A glukagon-kristályokat megfelelő módon — így centrifugálással — összegyűjtjük és 0,001 százalékos hideg sóoldattal mossuk. Az anyalúgot és a mosófolyadékot vissza visszük a folyamatba. A glukagon-kristályokat feloldjuk 9,5 pH-jú vizes ammóniumhidroxid (EDTA) butanol-oldatban és így olyan oldatot kapunk, amely 2—6 százalékban (súly/térfogat) tartalmaz ilyen kristályokat. Az oldat 1 liter ágytérfogatra vonatkoztatva 0,265—0,75 g szilárdanyagot és 0,1—1,875 g glukagont tartalmaz. Az összes oldat-térfogat az ágytérfogat 2,5—7,5 százaléka. A keletkező második oszlopra viendő glukagon-oldatot egy második Sephades G—50F töltésű oszlopra visszük, amelynek az ágytérfogata körülbelül 20 százalékkal nagyobb, mint az első oszlopé. Az oszlopot ezután az előzőekben leírt módon eluáljuk. A glukagon-koncentráció a glukagon-tartalmú eluálószerben 500—3500 mcg/ml. A glukagon kikristályosodik körülbelül 5—10 C° hőmérsékleten, miután az eluálószer pH-ját 7 és 8 közé állítottuk be. A glukagon-kristályokat ezután a szokásos módon összegyűjtjük. Az összes anyalúgot és a mosófolyadékot visszavisszük a folyamatba. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákon is bemutatjuk, de a lehetséges megvalósítások nem korlátozódnak csupán a példákban megadott módszerekre. Az 1. példában a fent leírt előnyös glukagontisztítási eljárást mutatjuk be, amelynél két gél-szűrési lépést használunk. A 2. és a 3. példák összehasonlításul szolgálnak és egy ismert glukagontisztítási eljárást mutatnak be a találmány szerinti gél-szűréssel kombinálva vagy anélkül. Mindegyik példánál ugyanazt a tisztítatlan glukagont használtuk. Ezt a glukagont két proteinfrakcióból kaptuk: (1) a cink-inzulin kristályok készítésénél elkülönített amorf protein-frakcióból és (2) a cink-inzulin közbenső termék cinkkel való kicsapása után visszamaradt citrát-puffer anyalúgból elkülönített frakcióból. A két protein-frakciót egyesítjük és az egyesített anyagot frakcionálisan kicsapjuk körülbelül 6,2 pH-nál 0,75 százalék nátriumklorid és 0,5 százalék fenol jelenlétében (mindkettő súly/térfogat arányban számítva). A frakcionálisan kicsapott proteineket a glukagontartalom megállapítása után egyesítjük és így olyan glu-5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
