179770. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dns-polimeráz enzim szilárd hordozóhoz való kötésére és ennek alkalmazása polideazoxinukleotidok szintézisére
5 179770 6 A gélről leengedett és kimosott (260 nm-nél ellenőrizve) reakcióelegyhez 0,65-szörös térfogatú 2,5 mólos NaCI — 0,038 mólos EDTA elegyet adunk, majd 70 °C-on tartjuk 10 percig. Lehűlés után azonos térfogatú kloroform-izoamilalkohol (24 : 1) eleggyel háromszor kirázzuk. A két fázist elválasztjuk (centrifugálással vagy fázis-szeparáló papíron, Whatman), a vizes fázist kétszer-desztillált vízzel dializáljuk (Bio-Fiber 50 Minibeaker, keverés, 4 °C, folyamatos üzem). A dializáló oldat vezetőképességét mérjük. Miután a vezetőképesség 0,8—1 liter átfolyt kétszer-desztillált víznél elérte a kétszer-desztillált víz értékét (0,2—0,6 uiS), további 0,4— 0,5 liter vízzel dializáljuk. Ezután szárazra liofilezzük, felvesszük 10-3 mólos TRIS.HCI (pH=7,4), 10-4 mólos EDTA oldatban (500 ;jű), és a kapott oldatból vett aliquotokból határozzuk meg a koncentrációját, UV- spektrumát, hőhiperkromicitását, templát aktivitását. A polimer oldatokat —25 °C-on tároljuk. Kontroll reakció: 165 p.! reakciócíegybe (azonos az immobilizált enzim-reakcióban használt eleggyel) térfogatarányos mennyiségű enzimet mérünk be, és 37 °C-on inkubáljuk. Mintavétel (25 jjl!) a kontrollálandó reakcióval egyidőben GF/C üvegszűrőre; feldolgozás, mérés a korábban leírtak szerint. Az immobilizált enzim tárolását és újrafelhasználását az alábbi módon végezzük : A reakcióelegy leengedése és kimosása után a gélt további 100 ml 60 mmólos kálium-foszfát pufferrel, majd 20 ml 0,02%-os nátrium-azid oldattal mossuk és ebben tároljuk az oszlopban vagy abból eltávolítva, 3—6 °C-on. A nátriumazid oldat kimosása után az enzim újra használható, eredeti aktivitása újrafelhasználásakor alig csökken (0—5%). A legtöbbször újravizsgált és legstabilabb immobilizált enzim az E. coli DNS-polimeráz T grade II enzim volt: két hónap alatt hat felhasználás során aktivitása nem változott. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) A szilárd hordozóhoz kovalens kötéssel rögzített DNS-polimeráz enzim a dezoxipolinukleotidok szintézisekor heterogén fázisú reakcióban vesz részt, a reakció befejezése után a reakcióelegvből denaturálás nélkül eltávolítható. b) A rögzített enzim többször felhasználható. c) A rögzített enzim folyamatos üzemmódban is használható. A találmány szerinti eljárást a következő példákon mutatjuk be. 1 1. példa a) A Thiopropyl-Sepharose előkészítése 1 g liofilezett, gyári kiszerelésű Thiopropyl-Sepharose 6B merkapttí reagenst, amely az 1. ábrának megfelelő reagens, 15 percig duzzasztunk szobahőmérsékleten 60 mmólos (mmól/literes koncentráció) kálium-foszfát pufferben (pH=7,4). Köpennyel és az alján üvegszűrővel ellátott 1,5 x 15 cm-es üvegoszlopba töltjük és 200 ml fenti pufferrel mossuk, hogy a gyárilag hozzákevert stabilizálószereket kimossuk belőle. b) A DNS-polimeráz enzim immobilizálása A leülepedett, buborékmentes gél feletti kb. 0,5 ml pufferbe 100 egység (20 p.1) 3850 egység/mg fehérje specifikus aktivitású E. coli MRE 600 DNS-polimeráz I, grade I enzimet (Boehringer-Mannheim GmbH terméke) mérünk be Hamilton mikropipettával. (1 egység DNS-polimeráz enzim 37 °C-on 10 mmól össznukleotidot épít be a savoldhatatlan polimerbe 30 perc alatt, megfelelő minta-láncindító komplex jelenlétében, meghatározott pufferben.) Lassú csepegéssel (0,1—0,2 ml/perc) a gélbe engedjük, és további 10 ml pufferrel szobahőmérsékleten belemossuk, majd tízszer cirkuláltatjuk perisztaltikus pumpával. c) A poli d(A—T) szintézise Az oszlopot 37 'C-ra temperáljuk termosztáttal, majd a gélbe engedünk 10 ml következő összetételű reakcióelegyet: 60 mmól kálium-foszfát (pH=7,4), 6 mmól magnézium-klorid, 1 mmól [3H]dATP (specifikus aktivitása 10,9 bomlás/perc.pmól), 1 mmól dTTP, 100 úrnői (P) aktivált poli d(A—T) láncindító komplex kétszer desztillált vízzel 10 ml-re oldva. A holttérfogatnak megfelelő 2—3 ml puffert elöntjük (spektrofotométerrel ellenőrizve), majd a reakcióelegyet perisztaltikus pumpával cirkuláltatjuk 0,5 ml/perc sebességgel. A reakció előrehaladását radioaktivitás méréssel követjük. 24 óra reakcióidő után a keletkezett polimer mennyisége a [3H]dAMP savoldhatatlan anyagba történt beépülése alapján 3,04 mg. A szubsztrát-felhasználás 45%-os. Az így nyert poli d(A—T)-bői dialízissel a kismolekulasúlyú anyagokat elválasztjuk. A tiszta nagy-molekulasúiyú natív poli d(A—T) mennyisége 2,2 mg. 2. példa Az immobilizált merkapto reagensen 150 egység (100 p.1) 116 egység/mg fehérje specifikus aktivitású E. coli MRE 600 DNS-polimeráz I, grade II enzimet (Boehringer-Mannheim GmbH terméke) rögzítünk az 1. példában leírt módon. A szintézist is az 1. példában leírt módszer szerint végezzük. Szubsztrátként 2 mmól [3H]dATP-t és 2 mmól dTTP-t használunk. Az ilyen módon 4 óra alatt szintetizált összes polimer mennyisége radioaktivitás mérés alapján 2,37 mg, a szubsztrátfelhasználás 18%-os. Az izolált és tisztított polimer kismolekulasúlyú (5—200 ezer Dalton), mennyisége 1,78 mg. 3. példa Az immobilizált merkapto reagensen 45 egység (50 [i.1) 6940 egység/mg fehérje specifikus aktivitású E. coli MRE 600 DNS-polimeráz I nagy fragmens enzimet (a Boehringer-Mannheim GmbH terméke) rögzítünk az 1. példában leírt módon. A szintézist is az 1. példában leírt módszer szerint végezzük. Szubsztrátként 0,5 mmól [3H]dATP-t és 0,5 mmól dTTP-t használunk. Az ilyen módon 24 óra alatt szintetizált összes polimer mennyisége radioaktivitás mérés alapján 2,74 mg, a szubsztrát-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
