179647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3a.alfa-h-4alfa-(3'-propanol)-7a.béta-metil-hexahidro-1,5-indandion hemiketál előállítására
7 179647 8 elegy keverésével, illetve az olvadt agar lemezek felületének flammálásával csökkenthető. A kontroll lemezeken nőtt tenyészeteket tápláló agar lemezre való rétegezéssel tisztítjuk. Ezt nem tehetjük meg az egyetlen szénforrásként AD-t tartalmazó kísérleti lemezekről származó tenyészetekkel. 28 °C-on való növesztés után az egyes steril kiónokat fogpiszkálóval leemeljük az agar lemezekről, újra megvizsgáljuk úgy, hogy szénforrásként AD-t tartalmazó, osztással ellátott lemezekre oltjuk. A tisztított izolátumot, melynek faji jellemzői a szülő-kultúráktól eltérőek, rázó-lombikban értékeljük ki. c) Rázó-lombikos kiértékelés 500 ml-es rázó-lombikba az alábbi összetételű biotranszformációs közegből 100 ml-t helyezünk: Glicerin 10,0 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfát 8,4 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát 4,5 g/liter ammónium-klorid 2,0 g/liter magnézium-szulfát—7 víz 0,3 g/liter vas(II)-klorid—6 víz 0,05 g/liter Desztillált víz q. s. 1 liter A közeghez 1 g/liter mennyiségű szójalisztet, majd ) g/liter szitoszterint keverünk. Miután az edényt 20 percig 121 °C-on sterilizáltuk, 28 °C-ra hűtjük le, és 10 ml csírával beoltjuk, melyet az alábbi módon növesztünk. Ab) pont szerint tisztított izolátumot ferde agaron tenyésztjük 28 °C-on. A ferde tenyészetből vett sejteket használjuk fel az 500 ml-es edényben levő 100 ml steril csíra-közeg beoltásához, amely a következő összetevőkből áll: Húsleves táp (Difco) 8 g/liter Élesztő kivonat 1 g/liter Glicerin 5 g/liter Desztillált víz q. s. 1 liter A pH-t IN nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk be, majd a lombikokat 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk. A csírákkal beoltott lombikokat 28 °C-on 72 óráig inkubáljuk. Mint fent említettük, 10 ml csíranövekményt használunk fel minden egyes 500 ml-es lombik beoltásához, amelyek 100 ml steril transzformációs közeget tartalmaznak. A lombikokat ezután forgó keverőn 28— 30 °C-on inkubáljuk és különböző időközönként mintát veszünk. A 10 ml-nyi mintákat 3 térfogatú metilén-kloriddal kirázzuk. Az extraktum részleteit vékonyréteg-kromatográfiával és gáz—folyadék kromatográfiával analizáljuk. Az előbbihez adszorbensként szilikagéit, és oldószerként a már fent is említett 2: 3 térfogatarányú acetát-ciklohexán elegyet használjuk. Az (I) és (V) képletű vegyületek kimutatása megerősíti a szitoszterin szelektív bontását, az M. fortuitum ATCC 6842-ből előállított újfajta mutáns segítségével. 2. példa Szitoszterin átalakítása (I) képletű vegyületté Ugyanazt a közeget használjuk, mint az 1. c) példában, azzal a különbséggel, hogy a pH értékét 6,5-re állítjuk be 4N nátrium-hidroxid segítségével. Ezt a közeget 121 °C-on 30 percig sterilizáljuk, majd 28 °C-ra hűtjük és 10 rész M. fortuitum NRRL B—8129 baktérium kultúrával beoltjuk, amelyet az 1. példa c) pontja szerint készítettünk. A beoltott keveréket 28 C-on 168 óráig inkubáljuk és közben keverjük, hogy a növekedést elősegítsük. Szükség esetén a pH-t nátrium-hidroxid vagy sav, például sósav hozzáadásával 5-ön tartjuk. A biotranszformáció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük, abszorbensként vékony szilikagél lemezt, oldószerként pedig 3 : 2 térfogatarányú ciklohexán-etilacetát elegyet használva. Ha már a biotranszformáció teljessé vált, a terméket a következőképpen izoláljuk : A reakcióelegyet metilénkloriddal extraháljuk, és az extraktumot diatoma-földön szűrjük, majd a szűrletet szárazra pároljuk. A szűrés maradékát Skellysolve B és 10% kloroform elegyével felvesszük és szilikagélen kromatografáljuk. Előhívó oldatként Skellysolve B-t, illetőleg annak egyre több etilacetátot tartalmazó elegyét használjuk. Ezzel a művelettel eluáljuk a kívánt (I) képletű vegyületet, amelynek Rf értéke 0,37 vékonyrétegkromatográfiánál (ciklohexán-etilacetát 3 : 2). A vegyület olvadáspontja 100—112 °C. 3. példa A 2. példában leírt eljárásban a szitoszterint koleszterinnel helyettesítve (I) képletű vegyületet kapunk. 4. példa A 2. példa szerinti eljárásban a szitoszterint sztigmaszterinnel helyettesítve (I) képletű vegyületet kapunk. 5. példa A 2. példa szerinti eljárásban a szitoszterin helyett kamposzterint alkalmazva (I) képletű vegyületet kapunk. 6. példa A 2. példa szerinti eljárásban a szitoszterin mellett vagy helyett a 2—5. példákban alkalmazott szterineket használva (I) képletű vegyületet kapunk. 7. példa Az 1. példában alkalmazott Mycobacterium fortuitum ATCC 6842-t más szterán bontó mikroorganizmussal, úgymint Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia és Streptomyces törzsekkel helyettesítve olyan mutánsokat kapunk, amelyek képesek szelektíven bontani a szteroidokat, amelyek adott esetben 2—10 szénatomos 17-alkil-oldalláncot tartalmaznak, és a fermentlében főként (I) képletű vegyület halmozódik fel. 8. példa Ha a 2—6. példában használt M. fortuitum NRRL B—8129-et a 7. példa szerinti mutánsokkal helyettesítjük az ott leírt eljárással (I) képletű vegyületet kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
