179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
39 179542 A IX. táblázatban közölt eredményekből látható, hogy a kemilumineszcens reakciórendszer által létrehozott fénykibocsátás maximális magnitúdója fordítva arányos a specifikus kötési reakcióelegyben levő biotin mennyiségével. így a találmány kompozíciót és eljárást biztosít a biotin ligandum jelenlétének kimutatására folyékony közegben olyan kompetitiv kötési-kemilumineszcens kimutatási technikát alkalmazva, amelynek esetében nem hasznosítunk enzim-katalizált követési reakciót. Ez a példa demonstrálja egy kemilumineszcens jelző rész használatát specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél. 11. példa Biotin-umbelliferon konjugát (XXV képletű vegyület), pontosabb néven 5-{cisz- hexahidro-2-oxo-lH-tieno(3,4-d)imidazol]- valériánsav-2-oxo-2H-l -benzopirán-7-ilészter előállítása. Száraz nitrogéngáz-atmoszférában -10 °C-on keverés közben 300 mg (1,2 millimól) vízmentes biotin 20 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatához hozzáadunk 0,17 ml (1,2 millimól) vízmentes trietil-amint, majd a kapott elegyhez cseppenként hozzáadjuk 0,141 ml frissen desztillált klórhangyasav-etilészter 3 ml vízmentes dietiléterrel készült oldatát. 30 percen át tartó keverés közben végzett inkubálás után száraz nitrogéngáz-atmoszférában a képződött csapadékot kiszűrjük, majd azonnal —10 °C-ra hűtjük. A csapadékhoz ezután 197 mg (1,2 millimól) vízmentes 7-hidroxi-kumarin 3 ml vízmentes piridinnel készült oldatát adjuk, majd az így kapott elegyet —10 °C-on 1 órán át, ezután 25 °C-on 24 órán át keverjük. Ezt követően nagyvákuumban 40 °C-on az oldószereket lehajtjuk, majd a maradékot lehűtjük, a kivált csapadékot kiszűrjük és metanolból átkristályosítjuk amikor is a 216—218 °C olvadáspontú cím szerinti vegyületet kapjuk. Elemzési eredmények a Ci9H20N2PsS képlet alapján: számított: C =48,75%, H =4,19%, N = 7,21%, talált: C =58,4%, H =5,12%, N = 6,86%. 12. példa Heterogén kompetitiv kötési-biolumineszcens kimutatási módszer biotin meghatározására, a biotin változó koncentrációjának hatása a maximális fényintenzitásra. Az ebben a példában alkalmazott biolumineszcens reakciórendszer a 3. példában ismertetett, illetve ábrázolt reakciókon alapul. A. Fényt kibocsátó oldat készítése. A 3. példában ismertetett módon fényt kibocsátó oldatot készítünk. B. Inszolubilizált specifikus kötőpartner készítése. Avidint - amely anyag a biotin specifikus kötőpartnere — inszolubilizálunk úgy, hogy kovalensen 20 vízben oldhatatlan polimerhez kötjük az alábbi módon: Az avidinnel való kötés céljából Sepharose 4B márkanevű gyantából (szállítója a Pharmacia AB, Uppsala, svéd cég) egy adagot March és munkatársai módszerével [Analytical Biochemistry, 60, 149 (1974)] aktiválunk, majd az aktivált gyantából közel 4 ml-t 8 ml 0,1 mólos citrát-pufferben (pH-ja 7,0) szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz ezután 9,9 egység/mg aktivitású avidinből 6 mg-t adunk 3 ml vízzel készült oldata formájában. (Egy egységnyi avidin az avidin azon mennyisége, amely képes 1 mikrogramm biotinnal specifikus kötést létrehozni.) A kapott reakcióelegyet ezután 7 °C-on 6 órán át keverjük, majd az avidint már tartalmazó Sepharose 4B gyantát kiszűrjük, 100 ml 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-pufferrel (pH-ja 9,0) mossuk és 240 ml 0,1 mólos trisz-(hidroxid-metil)- amino-metán-hidroklorid pufferben (pH-ja 8,0) újra szuszpendáljuk. C. Kontrollvizsgálatok. 9 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyikük össztérfogata 0,19 ml, mindegyik 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffert (pH-ja 8,0), 0,6 mól etanolt, 0,01 mól szemikarbazid-hidrokloridot tartalmaz, ezenkívül az egyes reakcióelegyek az alábbi X. táblázatban megadott mennyiségben NAD-t, NAD-biotin konjugátot, avidinnel kötött Sepharose 4B szuszpenziót (a példa B. részében ismertetett módon állítottuk elő) és Sepharose 4B szuszpenziót [úgy állítjuk elő, hogy 1 ml Sepharose 4B gyantát 60 ml 0,1 mólos, 8,0 pH-jú trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid pufferben szuszpendálunk] tartalmaznak. A reakcióelegyeket szobahőmérsékleten 15 percen át óvatosan rázzuk, majd a redukciós reakció elindítása érdekében minden egyes reakcióelegyhez 0,22 nemzetközi egységnyi mennyiségben alkohol-dehidrogenázt adunk. A c) reakcióban képződő acetaldehiddel (lásd a 3. példa elején) a szemikarbazid egy szemikarbazont képez, miáltal a c) reakció is a kívánt irányban megy végbe. Az alkohol-dehidrogenáz beadagolása után a reakcióelegyeket újabb 15 percen át keverjük, majd centrifugálás után felülúszó fázisukból 10-10 mikroliteres aliquotokat külön-külön beinjektálunk a 8. példában ismertetett fotométer küvettájába, amelybe 25 °C-on 2-3 percen át tartó előzetes inkubálást követően a már korábban elkészített, fényt kibocsátó oldatból 100 mikrolitert töltöttünk. A kapott eredményeket az alábbi X. táblázatban foglaljuk össze. Az 1. és 9. kontrollreakciók eredménye azt mutatja, hogy NAD és NAD-biotin konjugát távollétében csak igen kis intenzitású fény észlelhető. A 2. és 3. reakció eredményei azt mutatják, hogy ha a reakcióelegyben szabad NAD van jelen, akkor jelentős nagyságú fény képződik, és ezt a fényképződést az avidint tartalmazó Sepharose 4B gyanta jelenléte lényegében nem befolyásolja. A 4., 5. és 6. reakció eredményei azt mutatják, hogy az NAD-biotin konjugát aktív a fényt kibocsátó reakcióban, hogy a maximális fényintenzitás annál nagyobb, minél nagyobb a NAD-biotin konjugát mennyisége és hogy az avidint tartalmazó Sepharose 4B gyanta jelenléte inhibitálja a fénykibocsátást. A 3. és 5. reakciók eredményének a 40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
