179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 dóinak a jelentkező fényintenzitás csúcsértékére kifejtett hatását illusztráljuk. Az ebben a példában alkalmazott biolumineszcens reakciórendszer az alábbi reakciókon alapul: c) NAD-ligandum ♦ etanol alkohol-dehidrogenáz NADH-ligandum + acetaldehid d) NADH-ligandum * FMNi; + H® NADH-dehidrogenáz------------------------------------------->. NAD-ligandum + FMNH2 e) FMNH2 + hosszú szénláncú aldehid + 02 luciferáz + hosszú szénláncú sav + H2 O + hv 1) flavin-mononukleotid A d) és az e) reakciók végrehajtásához először áz alábbi, fényt kibocsátani képes oldatot készítjük el. Először reagenskeveréket készítünk, amely 7,0 pH-értékű 0,13 mólos foszfát-puffer alapú, továbbá 0,67 súly% szarvasmarha-szérumalbumint, 15,7 mikromól flavin-mononukleotidot (FMN) és 13,3 millimól nátrium-acetátot tartalmaz, majd a reagenskeveréket fénytől elzárt helyen —20 °C-on tároljuk. Azon a napon, amikor a fényt kibocsátani képes oldatot használni akarjuk, elkészítjük 5 mikroliter dodekanol emulzióját 5 ml vízzel. Photobacterium fisheri baktériumból extrahálás útján kapható, liofilizált luciferázt (az enzimet a Worthington Biochemical Corp., Freehold, New-Yersey állam, amerikai egyesült államokbeli cég forgalmazza) adagolunk 20 mg/ml koncentrációban 7,3 pH-értékű 0,013 mólos foszfátpufferhez. 30 perc elteltével a kapott szuszpenziót 1500 g-vel centrifugáljuk 10 percen át, a kivált szemcsés szilárd anyagot pedig eldobjuk. Ezután a fényt kibocsátani képes oldatot felhasználás előtt 5 percen belül elkészítjük 75 mikroliter reagenskeverék, 5 mikroliter dodekanal-szuszpenzió és 20 mikroliter luciferáz-oldat kombinálása útján. Az e) reakció által kibocsátott fény detektálására olyan fotométert konstruáltunk, amely egy fotodetektorból és egy 6 mm x 50 mm nagyságú küvettából áll, az utóbbira pedig egy fényintegráló lencse van szerelve, amely a küvettában kibocsátott fényt a fotodetektorra vetíti. A fotodetektor által képzett elektromos jelet X,Y-rögzítőbe vezetjük. A fényintenzitás csúcsát, illetve csúcsait a rögzített jelből állapítjuk meg, és a rögzítőszalag beosztásán alapuló egységek számával jellemezzük. 7 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 0,2 ml és mindegyik 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid puffert (8,0 pH-értékű), 0,6 mólos etanol-oldatot, 0,01 mólos szemikarbazid-hidroklorid-oldatot, továbbá az 1. példában ismertetett módon előállított NAD-biotin konjugátból 343 nanomólt, 0,025 nemzetközi egységnyi alkohol-dehidrogenázt és 0,055 nemzetközi egységnyi avidint tartalmaz. A 7 reakcióelegy közül hathoz, vagyis az alábbi II. táblázat 1—7. reakcióelegyei közül a 2—7. sorszámú reakcióelegyekhez az ugyancsak a táblázatban jelzett koncentrációkban biotint adunk. A reakcióelegyeket ezután a szobahőmérsékleten 25 közel 30 percen át inkubáljuk. Ezt követően minden egyes reakcióelegyből 10—10 mikrolitert a fent ismertetett fotométerbe szerelt küvettába bemérünk (a küvetta a fent ismertetett, fényt kibocsátani képes oldatból 100 mikrolitert tartalmaz), majd 28 °C-on 2—3 percen át tartó inkubálást végzünk. Minden egyes kísérletet kétszeresen végzünk el, és az átlagolt eredményeket az alábbi II. táblázatban adjuk meg. II. táblázat 26 Reakcióelegy sorszáma Biotin koncentrációja nanomólban Átlagos maximális fényintenzitás 1 0 36 2 25 44 3 50 57 4 100 79 5 150 90 6 200 97 7 300 104 A táblázatban foglalt adatokból látható tehát, hogy a biolumineszcens reakcióelegy által előidézett maximális fényintenzitás magnitúdója, és így az NAD■biotin konjugátban levő NAD aktivitása egyenesen arányos a specifikus kötési reakció foganatosítására szolgáló reakcióelegyben levő biotin mennyiségével. A találmány tehát egy tesztkompozíciót és egy módszert biztosít a biotin mint ligandum kvantitatív meghatározására egy folyékony mintában a kompetitiv kötési, biolumineszcenciát hasznosító kimutatási technikával. Ez a példa demonstrálja egy, kemilumineszcensen mérhető koenzim használatát jelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél. 4. példa 2,4-Dinitro-fenil-fluoreszcein konjugát, azaz fluoreszcein-3’,6’-bisz-[6-(2.4- -dinitro-anilino)-hexanoát]előállítása A cím szerinti vegyület szintézise alapvetően abban áll, hogy 6-(2,4-dinitro-anilino)-hexánsav-kloridot & fluoreszcein dinátriumsójával reagáltatunk. A 6-(2,4-dinitro-anilino)-hexánsav a Biochem. J., 42, 287—294 (1948) irodalmi helyen ismertetett módon állítható elő. Közelebbről úgy járunk el, hogy 1,5 g (5 millimól) 6-(2,4-dinitro-anilino)-hexánsavat oldatban savkloriddá alakítunk 10 ml meleg tionil-kloriddal 15 percen át végzett reagáltatás útján, majd a reakcióelegyet lehűtjük és 20 ml hexánnal hígítjuk. A kivált szilárd savkloridot ezután kiszűrjük, alaposan szárítjuk és hozzáadjuk 600 mg fluoreszcein-dinátriumsó 10 ml vízmentes acetonnal készült oldatához. A kapott reakcióelegyet ezután 5 órán át visszafolyató hűtő alkalmazásával forraljuk, majd 2 ml víz és 5 ml aceton elegyével kilúgozzuk. 25 “T-on 30 percen át tartó állás után a reakcióelegyet szárazra pároljuk, majd a kapott maradékot megosztjuk etil-acetát és vizes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
