179396. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-oxo-L-gulonsav előállítására
5 179396 6 Az előbbiekben leírt fermentáció során képződött 2-oxo-L-gulonsav vagy sója a szakember számára ismert módszerekkel különíthető el és tisztítható. Eljárhatunk például úgy, hogy a fermentlevet szűrjük és a 2-oxo-L-gulonsavat vagy annak nátrium vagy kalcium sóját valamely, a vegyületet nem oldó oldószer, például egy rövidszénláncú alkanol, különösen metanol vagy etanol hozzáadásával kicsapjuk. Alkalmazhatunk más elkülönítési módszereket is, például az oldószert eltávolíthatjuk, például fagyasztva szárítással. Ha a 2-oxo-L-gulonsavat só alakjában különítjük el, a szabad savat úgy állíthatjuk elő, hogy a sóoldathoz ásványi savat. - például kénsavat vagy sósavat — adunk, vagy kationcserélő gyantát alkalmazunk. Ha a 2-oxo-L-gulonsavat szabad savként különítjük el, a megfelelő sókat könnyen előállíthatjuk a szokásos módszerekkel, például egy megfelelő alkálifémhidroxiddal vagy-karbonáttal vagy egy alkálifémkarbonáttal történő reagáltatás útján. A találmányt a következőkben példák kapcsán mutatjuk be, azonban nem korlátozzuk azt a konkrét kiviteli példákra. 1. példa Elkészítjük a következő összetételű inokulum táptalajt (pH= 7,0), szorbit 3 g/liter élesztőkivonat 2 g/liter pepton 2 g/liter káli um-hidrogénfoszf át 1 g/liter magnéziumszulfát (7 molekula kristályvízzel) 0,2 g/liter Egy 300 ml-es lombikot — amely 100 ml ilyen inokulum táptalajt tartalmaz - Citrobacter freundii ATCC 6750 sejtekkel oltunk be (egy tápagart tartalmazó kémcsőtenyészetet 10 ml steril vízzel lemosunk és a szuszpenzió 1 ml-ét használjuk fel a beoltáshoz). A sejteket 24 órán át 28 °C hőmérsékleten, körrázógépen tenyésztjük. 100 ml következő összetételű (pH =6,7) fermentációs táptalajt mérünk be 300 ml-es lombikokba: glükóz-monohidrát (cerelose) 2 g/liter ammónium-hidrogénfoszfát 1 g/liter kálium-dihidrogénfoszfát 1 g/liter magnéziumszulfát (7 molekula kristályvízzel) 0,5 g/liter répa-melasz 2 g/liter glicin 0,2 g/liter a lombikokat beoltjuk 5 térf./térf.% fent leírt, 24 órás inokulum tenyészettel és 22 órán át körrázógépen rázatjuk, ekkor a pH 5. Az Acetobacter cerinus IFO 3263 törzs glükóz-tartalmú táptalajban 28 °C-on, 50 órán át való tenyésztésével előállítunk egy 15-20% (súly/térf.) nátrium-2,5-dioxo-D-glükonátot tartalmazó fermentlevet, ebből 15ml-t hozzáadunk a Citrobacter freundii tenyészethez és a pH-t nátriumhidroxid hozzáadásával 6,5-re állítjuk be. A fermentációt 28 °C-on folytatjuk, a pH-t 24 óránként 6,5-re állítva be. 52 óra alatt a 2,5-dioxo-glükonát lényegében felhasználódik, ekkor a kündulási 2,5-dioxo-D-glükonátra számítva kb. 30%-os kitermeléssel kapjuk a nátrium-2 oxo-L-gulonátot. 2. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg egy kísérlet-sorozatban, a Citrobacter freundii ATCC 6750 törzs helyett ATCC 8090, 8454, 10787, 11102, 11606, 11811 és 14135 tözset és Citrobacter diversus ATCC 27026, 27027, 27028 és 27156 törzset alkalmazva és igazoljuk a 2-oxo-L-gulonsav képződését. 3. példa Az 1. példa szerinti inokulum táptalajt Citrobacter freundii ATCC 6750 törzs sejtjeivel (10 ml vizes steril szuszpenzió 1 ml-ével) oltjuk be és a sejteket 20 órán át 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük. 1800 ml, az 1. példa szerinti táptalajt bemérünk egy 4 liter térfogatú kevertethető edénybe, beoltjuk a fent leírt, 20 órás inokulum tenyészettel — 5 térf./térf.% mennyiségben - és 8 órán át folytatjuk a tenyésztést 28 °C hőmérsékleten, 1750 ford./perc sebességgel végezve a kevertetést olyan propeller-keverővei, amely 0°C hajlásszögű és a közeg 1 térf./térf./perc arányú levegőztetését biztosítja. 8 órás tenyésztés után hozzáadunk 200 ml fermentlevet, amely 15—20 (súly/térf.)% 2,5-dioxo-D-glükoriátot tartalmaz, az 1. példa szerint. A pH-t nátriumhidroxid hozzáadásával 6,5-re állítjuk be és a levegőztetési sebességet 0,3 térf./térf./perc-re csökkentjük. A fermentációt 28 °C-on folytatjuk és a pH-t óránként 6,5-re állítjuk be. 48 órai tenyésztés után a 2,5-dioxo-D-glükonát lényegében felhasználódik, a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonát súlyára számítva 25%-os kitermeléssel kapjuk a nátrium-2-oxo-D-gulonátot. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 2-oxo-L-gulonsav vagy sója előállítására, azzal jellemezve, hogy 2-oxo-L-gulonsavat termelő Citrobacter freundii ATCC 6750, (Escherichia intermedia ATCC 21073) 8090, 8454, 10787, 11102, 11606, 11811, 14135, Citrobacter diversus ATCC 27026, 27027, 27028 vagy 27156 mikroorganizmus törzset vizes táptalajban tenyésztünk, 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sója jelenlétében. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 25-dioxo-D-glükonsav sóként nátrium-2,5-dioxo-D-glükonátot alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatoátási módja, azzal jellemezve, hogy 2,5-dioxo-D-glükonsav sókált kalcium-2,5-dioxo-D-glükonátot alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatoátási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 5,5-7,5 pH-n végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
