179360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timidin-foszforiláz előállítására
3 179360 4 „bár in vitro a timidin akadályozza a trimetoprim/szulfametoxazol aktivitását, de in vivo a trimetoprim/szulfametoxazol aktivitásának befolyásolásához az állati szervezetekben általában nem elég nagy a timidin töménysége”. Lízisnek alávetett ló-szérum hozzáadása a táptalajhoz hátrányos, mert egyrészt pirosas-barna szint kölcsönöz a közegnek, másrészt meghatározhatatlanná teszi tulajdonképpen a közeget. További nehézséget okoz, hogy sterilizált lószérum igen kis mennyiségben áll rendelkezésre, az egész világon csak kevés helyen kapható. Ismeretes, hoggy a baktériumoknak antifolát hatású gyógyszerekkel szemben mutatott érzékenysége jobban vizsgálható olyan, egyébként hagyományos táptalajon, amely bakteriális eredetű, tisztított timidin-foszforilázt is tartalmaz (3445/75 számú, nagy - britanniai szabadalmi bejelentés). Az enzim használatát korlátozza az a tény, hogy csak bizonyos formában stabil. Ismeretes, hogy a bakteriális eredetű timidin-foszforiláz -20 °C-on stabil, de 4 °C-on gyorsan csökken az aktivitása [Schwartz, Eur. J. Biochem. 21, 191 (1971)]. A 2 602 996 számú, Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint az enzim ammónium-szulfát szuszpenzióban vagy 5 mg/ml-nél nagyobb fehérje-koncentráció esetén 10%-os ammónium-szulfát oldatban stalil. Az ilyen tárolási formáknak is azonban több hátránya van. A szuszpenzió gyorsan leülepszik, nehezen mérhető ki belőle aliquot rész és nehezen sterilizálható az enzim denaturációja nélkül, mivel a szűrés módszere nem alkalmazható. A 10%-os ammónium-szulfát oldatban levő tömény enzim-oldat drága, egy adag a többszörös használat miatt könnyen fertőződhet, és a megfelelő stabilitás eléréséhez szükséges töménységben az oldat 1 ml-e 2000 nemzetközi egység (I. U.) mennyiségű enzimet tartalmaz, amely 100 liter közegben elegendő. Szükség volt ezért olyan körülményeket keresni, amelyek között az enzim mind híg mind tömény formában stabil. Az Escherichia coli-ból kinyert timidin-foszforiláz kinetikai analízise azt mutatta, hogy az enzim timinnel és foszfáttal bizonyos körülmények között olyan komplexet képez, amely inaktív (':ead-end komplex), de megbontható, mielőtt az enzim katalitikusán aktív komplexet képez. A megfigyelésekből arra lehetett következtetni, hog> a dead-end komplex stabilabb a szabad enzimnél. Mivel a timin jelenléte nem előnyös a táptalajban, keresni kellett helyette valami mást. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy uracil és szervetlen foszfát, így kálium-foszfát, kombinációja igen hatásosan stabilizálja a timidin-foszforilázt mind tömény, mind hígított formában. Fentiek alapján találmányunk tárgya eljárás stabil timidin-foszforiláz előállítására uracil és szervetlen foszfát hozzáadásával. A timidin-foszforilázt baktériumokból, így Salmonella typhimurium-ból, Bacillus cereus-ból, Bacillus stearothermophilus-ból, Haemophilus influenzae-ből és különösen olyan Escherichia coli törzsből állítjuk elő, amely növekedéséhez timin és metionin szükséges. A tisztítást Schwartz [Eur. J. Biochem. 21, 191-198 (1971)] módszerével is végezhetjük, amely kicsapásból, frakcionálásból, kromatográfiás eljárásból és dialízisből áll, de ez hosszadalmas eljárás. Előnyösebb a 2 602 996 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban leírt módszer. Eszerint olyan Escherichia coli törzset alkalmazunk, amely megfelelő növekedési körülmények között rendkívül nagy mennyiségű timidin-foszforilázt termel, és az enzimet speciális adszorbens alkalmazásával kinyerjük a sejt-kivonatból, majd az adszorbensről eluáljuk az enzimet. Az eluálás után nyert enzim tisztább a Schwartz-féle módszerrel kapott enzimnél, és a kitermelés ugyancsak jobb, mint a Schwartz-féle módszerrel. A tisztítási eljárás során az eluátum abszorpcióját adott hullámhosszon folyamatosan mérjük abból a célból, hogy az enzim aktivitását nemzetközi egységben (I.U.) tudjuk meghatározni. Egy nemzetközi egység (I.UJ az az enzim mennyiség, amely a meghatározás körülményei között 1 pmol timidint alakít át timinné (lásd 1. példa). A legnagyobb töménységű és aktivitású csúcsokat választjuk ki. Az előbbiekben leírt módon tisztított enzimet uracil és szervetlen foszfát hozzáadásával stabilizáljuk. Bár igen sokféle só alkalmazható, előnyösen kálium- és ammónium-foszfátot alkalmazunk. A táptalajban a timidin- foszforiláz töménysége előnyösen 0,01-1000, még előnyösebben 0,02—10 nemzetközi egység (I.U.)/ml közé esik. Stabil timidin-foszforiláz-készítményhez jutunk, ha az uracil töménységét 0,5 mM és a telítettség, előnyösen 1— 20 mM között, a szervetlen foszfát töménységét pedig 0,1 mM és a telítettség, előnyösen 0,1—1,0 M között választjuk meg. Bizonyos esetekben megfigyeltük, hogy az enzim-készítmény átszűrése aktivitás-veszteséget okoz. Azt találtuk, hogy szérum-albumin, így marha eredetű szérum-albumin hozzáadásával kivédhető az aktivitás-veszteség. Fentiek alapján úgy készítünk stabil timidin-foszforilázt, hogy az uracilt és szervetlen foszfátot tartalmazó oldathoz még szérum-albumint is adunk az aktivitás-veszteség megakadályozásának céljából. Az albumin töménysége előnyösen 0,2—5%. Igen lényeges, hogy a fentiekben leírt készítmény steril legyen, különösen abban az esetben, ha a készítményt baktériumoknak antifolátokkal szemben mutatott érzékenységének vizsgálatánál alkalmazzuk. A sterilitás biztosításának érdekében a készítményhez mikroba-ellenes szert is kell adni. Igen fontos, hogy a készítmény sterilitását biztosító mikroba-ellenes szer ne befolyásolja az enzim aktivitását. Azt találtuk, hogy az alkálifémek azidjai, így a nátrium- és kálium-azid, igen alkalmas mikroba-ellenes szerek, mert nem befolyásolják az enzim aktivitását és a készítmény felhasználásakor dyan nagy mértékben felhígulnak, hogy hatástalanná válnak. Fentiek alapján úgy állítunk elő stabil és steril timidin-foszforiláz-készítményt, hogy az enzim-oldat5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
