179290. lajstromszámú szabadalom • Eljárás baromfipestis elleni oltóanyag előállítására
3 179290 4 kialakított hidegtűrő, hőmérsékletérzékeny mutáns törzsként ismertették. Ugyanezen szerzők egy későbbi közleményükben („Potential as an aerosol vaccine of an improved Newcastle disease vaccine derived from the La Sota strain. I. In vitro studies” /International Symposium of the Worldwide Association of Veterinarians, Microbiologists, Immunologists and Specialists in Infectious Illnesses, Tunisz, 1976. augusztus 8—szeptember 2./) kifejtették, hogy a P/76/5 törzs fertőzi a csirkeembrió-kötőszöveteket. Az előadás kivonatát a szimpózium rendező szerve (A. M. V. M. I., Maisons-Alfort, Franciaország) nyomtatásban is megjelentette. Mindezek a sajátságok az adott NDV-törzs gyengítettségi fokát jellemezhetik. Miként Nagai és munkatársai kimutatták [Virology 72, 494 (1976)], összefüggés áll fenn a különböző NDV-törzsek patogenicitása és sejttenyészetekben észlelhető fertőzőképessége között. A legyengített törzsek definíciószerűen csökkent fertőzőképességgel rendelkeznek, a fertőzőképesség azonban fokozható, ha a vírust tripszinnel kezelik. Azt tapasztaltuk, hogy a P/76/5 törzs csirkeembrió-kötőszöveten kifejtett fertőzőképessége lényegesen kisebb az alaptörzsénél (azaz a La Sota törzsénél), és tripszin jelenlétében a P/76/5 törzs fertőzőképessége lényegesen nagyobb mértékben fokozódik, mint a La Sota törzsé. Ezek a tapasztalatok a P/76/5 törzs legyengített jellegével hozhatók összefüggésbe. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy ha a P/76/5 NDV-törzset csirkeembrió-kötőszöveten, a letörő hőmérsékleten — pontosabban két ízben sorozattenyésztésnek vetjük alá, olyan új törzshöz jutunk, amely elveszíti a P/76/5 törzs hidegtűrő és hőmérsékletérzékeny jellegét, azonban csirkeembrió-kötőszöveten a P/76/5 törzsével azonos csökkentett fertőzőképességgel rendelkezik, és fertőzőképessége tripszin jelenlétében a P/76/5 törzs fertőzőképességéhez hasonlóan fokozható. A fenti eljárással kialakított új NDV-törzset a WHO Collaborating Centre for Collection and Evaluation of Data on Comparative Virology intézetben P/77/8 számon helyeztük letétbe. A találmány szerinti eljárással kialakított új NDV-törzs meglepően nagyobb immunogén hatást vált ki, mint a megfelelő hidegtűrő és hőmérsékletérzékeny alaptörzs (azaz a P/76/5 törzs). Kísérleteink szerint a fenti eljárással kialakított új törzset — azaz a P/77/8 törzset — tartalmazó vakcinák hatásos dózisa (a kezelt állatokon 100%-os szérumkonverziót kiváltó dózis) 10® EID50/28,3 dm3 levegő, azaz tizedrésze a P/76/5 törzset tartalmazó vakcinák hatásos dózisának. A találmány szerint tehát javított tulajdonságokkal rendelkező, a Newcastle-kór ellen felhasználható, aeroszolos készítmény formájában adagolható vírus-vakcinákat állíthatunk elő. Ezek a vírus-vakcinák hatásos mennyiségű P/77/8 NDV-törzset és aeroszolos adagolásra alkalmas gyógyszerészeti hígítószert tartalmaznak. A javított tulajdonságokkal rendelkező NDV-vakcinákat a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy P/76/5 NDV-törzset csirkeembrió-kötőszöveten, szaporodást 41 V-on -a szaporodást letörő hőmérsékleten két lépésben sorozattenyésztésnek vetünk alá, a második lépésben kapott törzset összegyűjtjük, és a kapott törzset önmagában ismert módon aeroszol formájában ada- 5 golható élő vírus-vakcinává alakítjuk, mimellett a vakcinát előnyösen fagyasztva szárítjuk, és a vakcinához a fagyasztva szárítás előtt célszerűen stabilizálószert adunk. A találmány szerinti eljárás nagyüzemi megvalósító tása során például úgy járhatunk el, hogy a fenti módon kialakított P/77/8 NDV-törzset 34-37 °C-on specifikus, patogénmentes, embriót tartalmazó tyúktojásokban tenyésztjük, és a vírust például 3 napos inkubálási idő elteltével összegyűjtjük. 15 Az összegyűjtött vírushoz ezután előnyösen egy stabilizáló oldatot adunk, a keveréket üvegfiolákba töltjük, majd fagyasztva szárítjuk. Stabilizáló oldatként például pepton, arginin és/vagy szacharóz vizes 2o oldatait alkalmazhatjuk. A vakcinákat fagyasztva szárított állapotban, szorosan ledugaszolt fiolákban tároljuk, és beadás előtt vízzel elegyítjük. A találmány szerint előállított vakcinákhoz tet- 25 szés szerinti egyéb, aeroszol formájában adagolható, szárnyasok légzőszervi megbetegedéseinek megelőzésére (például a fertőző szárnyas-bronchitis megelőzésére) alkalmas élő vakcinát (vakcinákat) is adhatunk. 30 A vakcinás kezelés során a vakcinát közvetlenül a beadás előtt vízzel hígítjuk, majd önmagában ismert módon, aeroszol formájában beadjuk a kezelendő szárnyasoknak. A szárnyasok — elsősorban csirkék — kezelésére legalább 106 EIDso/28,3 dm3 le- 35 vegő P/77/8 NDV-törzset tartalmazó aeroszolos készítményeket használunk fel. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 40 1. példa 45 á Egyrétegű csirkeembrió-kötőszövetet (10 sejt) 0,2 ml szuszpenzióval oltjuk be, amely milliliterenként 105 EID50 P/76/5 vírust tartalmaz. A beoltott sejtekre 2 térfogat % borjúembrió-szérummal kiegé- 50 szített Eagle-féle minimum-táptalajt töltünk, és a rendszert 4 napon át 41 °C-on inkubáljuk. Ezután a felső folyadékfázist elkülönítjük. A hígítatlan felső folyadékfázis 0,2 ml-es alikvot 55 részleteivel (koncentráció: 102’5 TCIDso/ml /a sejttenyészetek 50%-át megfertőző dózis/) egyrétegű csirkeembrió-kötőszövetet oltunk be, és a beoltott sejteket az első tenyésztési lépésnél ismertetett módon inkubáljuk. 60 A második tenyésztési lépésben kapott felső folyadékfázissal specifikus patogénmentes tojásokat oltunk be, és végpont-hígítással 35 °C-on klónozzuk. A kapott kiónt specifikus patogénmentes tojásokban 3 napon át 35 °C-on tenyésztjük. A P/77/8 55 törzs oltótenyészetéhez jutunk. 2
