179041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-076 vegyületek és azokat tartalmazó féregírtószerek előállítására
19 179041 20 fertőzés ellen. Továbbá a kloroformos extrakcióval a C-076 70-szeres tisztítását éljük el. 3. példa A lépés 50 ml 7. táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot beoltunk egy fagyasztott ampullában levő Streptomyces avermitilis MA-4680 törzzsel. A lombikot 28 °C-on 160 percenkénti fordulatszámú és 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú rotációs rázó berendezésen inkubáljuk 24 óráig. 7. táptalaj Dextróz 1 g CPC ipari módosított keményítő 10 g Hús kivonat 3 g NZ amin E 5 g Autolizált élesztő (Ardamine pH) 5 g Magnézium-szulfát *7H20 0,05 g Dinátrium-hidrogénfoszfát 0,19 g Kálium-dihidrogénfoszfát 0,182 g Kalciumkarbonát 0,5 g Desztillált víz 1000 ml pH = 7,0-7,2 B lépés 500 ml 7. táptalajt tartalmazó 2 két literes Erlenmeyer lombikot beoltunk az A lépés termékét tartalmazó lombik 10 ml-ével. A táptalajt 28 °C-on 160 percenkénti fordulatszámú 5,08 cm-es kör alakú pályájú rázó berendezésen 24 óráig inkubáljuk. C lépés 467 liter 8. táptalajt tartalmazó 756 literes rozsdamentes acél fermentorba 1 liter B lépésből származó fermentációs táptalajt adunk. A fermentor tartalmát 28 °C-on 130 percenkénti fordulatszámmal 96 óráig kevertetjük és 10 láb3/perc levegő áramlási sebességgel levegőztetjük. 8. táptalaj Paradicsompép 20 g/liter Primér élesztő N. F. 10 g/liter Módosított keményítő, CPC 20 g/liter Kobaltklorid • 6H2 O 5 mg/liter Folyglykol 2000 0,321 ml/liter Desztillált víz tetszés szerint pH = 7,2-7,4 Ezután 15,5 liter fermentlét leszűrünk és a C—076-t tartalmazó micéliumokat vízzel mossuk. 2,268 g nedves micéliumot keverés közben 3 liter acetonnal extrahálunk. Az elegyet leszűrjük és a szűrletet 1550 ml-re koncentráljuk és a pH-t híg sósavval 4,0-re állítjuk be. Az oldatot 3-szor extraháljuk egyenlő térfogatú kloroformmal. A kloroformos extraktumot száraz „Infusorial Earth” (Super-Cel)-en keresztül történő szűréssel szárítjuk, egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A maradék olajos C—076 súlya 5,12 g. 3,3 mg teljesen hatásos az egéren található N-dubius ellen. 4,69 g olajat 142 ml kloroformban oldunk és 90 g szilikagélt tartalmazó, kloroformmal töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 1400 ml kloroformmal hívjuk elő. Az oszlopot utána kloroform és etanol 49 :1 arányú elegyével eluáljuk és az egyenként 5 ml-es 146—226 frakciókat szedjük. A 49—72 frakciókat összesűrítjük és szárazra pároljuk. 200 mg (A) olajat kapunk. A 79—184 frakciókat szintén összeöntjük és bepároljuk, ennek eredményeképpen 291 mg olajat (B) kapunk. Az egyes frakciók 400 /ig-ja teljesen hatásos az N.dubius ellen egéren. A két frakciót (A és B) külön analizáljuk szilikagél vékonyréteg kromatográfiás lemezen (Quanta/Gram QIF lemezen, Quanta/Gram Inc. Fairfield, New Jersey). A lemezeket kloroform és metanol 19 :1 arányú elegyével hívjuk elő. A foltokat megvizsgáljuk ultraibolya aktivitás szempontjából és az egyes frakciók egy foltja a C—076 vegyületekre jellemző ultraibolya abszorpciót mutatja (lásd I. táblázat). Az A frakcióból az Rp = 0,83 értékű folt és a B frakcióból az Rp = 0,57 értékű folt mutat ilyen abszorpciót. Ezek a foltok a C-076 A és C—076 B vegyületeket képviselik. Az (A) olaj 198 mg-ját kloroformmal töltött 80 g szilikagél oszlopon kromatografáljuk, 199 :1 arányú kloroform : metanol eleggyel eluáljuk, amíg 520 ml-t gyűjtünk össze, majd 99 :1 arányú kloroform/metanol elegygyei 10 ml-es frakciókat szedünk. A 630-720 mlfrakció 30,4 mg, a 730-950 ml frakció 78,4 mg és a 950-1040 ml frakció 20 mg olajos anyagot ad. A C-076 A komponenst tartalmazó 1 és 2 frakciók 1,0, 0,5 és 0,25 mg dózis szintén hatnak teljesen az N. dubius ellen egéren. 4. példa A lépés 50 ml 8. táptalajt tartalmazó 250,ml-es Erlenmeyer lombikot beoltunk Streptomyces avermitilis MA 460 fagyott ampulla tartalmával. A lombikot 160 percenkénti fordulatszámú 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú rázó berendezésen 28 °C-on 24 óráig inkubáljuk. B lépés 500 ml 8. táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer lombikot az A lépésben kapott termék 10 ml-ével oltunk be. A táptalajt 28 °C-on 160 percenkénti fordulatszámú és 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú rázó berendezésen 24 óráig inkubáljuk. C lépés 160 liter 9. táptalajt tartalmazó 189 literes rozsdamentes acél fermentorba 500 ml B lépésben kapott inoculumot adunk. A fermentort 28 °C-on 150 percenkénti fordulatszámmal való keverés közben 24 óráig inkubáljúk és 1,41 liter/s sebességgel levegőztetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
