179041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-076 vegyületek és azokat tartalmazó féregírtószerek előállítására
7 179041 8 kalcium-klorid • 2H2 O g Polyglycol P2000 2,5 ml magnézium-szulfát ’7H20 0,1 g kobaltklorid - 6H2 O 0,01 g vassszulfát • 7H2 O 0,01 g desztillált víz 1000 ml pH = 6,5 B táptalaj oldható keményítő 20,0 g kukoricalekvár 15,0 g cerelóz 5,0 g szójabab-liszt 4,0 g ammónium-szulfát 4,0 g kukoricaliszt 1 S szójabab olaj 2.5 ml kalium-dihidrogénfoszfát 0,3 g kalcium-karbonát 6,0 g desztillált víz 1000 ml pH = 6,7 C táptalaj paradicsompép 40,0 g zab-liszt 15,0 g desztillált víz 1000 ml pH = 6,0 D táptalaj zabliszt 20,0 g paradicsompép 20,0 g desztillált víz 1000 ml pH = 5,5 E táptalaj dextróz 10,0 g pepton (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). 5,0 g élesztő autolizátum (Ardamin pH Yeast Products Inc., Paterson, New Jersey). 3,0 g nátrium-klorid 12,7 g Kálium-klorid 0,72 g vas-szulfátammónium-szulfát '6H20 0,035 g magnézium-klorid • 6H20 5,32 g kalcium-klorid *2H20 0,73 g desztillált víz 1000 ml pH = 7,4 A C-076 termelő mikroorganizmusok alkalmazásával végrehajtott fermentálást 20—40 °C-on végezzük. Optimális eredmények elérése végett ezeket a fermentációkat 24-30 °C körüli hőmérsékleten végezzük. A legelőnyösebb hőmérséklet 27-28 C. A táptalaj pH-ja előnyösen 5,9-9,0, különösen 6,0-7,5. Laboratóriumi méretekben a fermentálást úgy végezzük, hogy ismert steril ~módszerek alkalmazásával megfelelő mennyiségű táptalajt egy lombikba helyezünk és beoltjuk Streptomyces avermitilis C—076 termelő törzs spóráival vagy vegetatív sejt növekményével, vattával lazán bedugaszoljuk a lombik nyakát és a fermentálást állandó szobahőmérsékleten 28 °C-on rotációs rázókészüléken 3-10 napig hagyjuk végbemenni. Nagyüzemi méretekben előnyös, ha a fermentációt keverővei ellátott tartályokban végezzük és a fermentlevet szellőztetjük. A táptalajt behelyezzük a tartályba és sterilizálás után Streptomyces avermitilis C—076 termelő törzs vegetatív sejt növekményének megfelelő forrásával beoltjuk. A fermentálást 1—8 napig végezzük, miközben 24-37 °C-on kevertetjük és/vagy szellőztetjük a táptalajt. A levegőztetés foka sok tényezőtől függ, így például a fermentor mérete, a keverés sebessége, stb. Általában a nagyüzemi fermentációk közben a keverés sebessége 95-150 fordulatszám percenként és 0,94—9,40 liter/s levegő. A C—076 vegyületek a Streptomyces avermitilis fermentációjának befejezése után elsősorban a micéliumban találhatók és az alább leírt módon izolálhatok és választhatók el egymástól. A négy nagyobb és négy kisebb Streptomyces avermitilis által termelt C—076 komponenst izoláljuk. A különböző vegyületek neve C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a, B2b. A nagyobb komponensek kapták az „a” megjelölést és a kisebb komponensek a „b” megjelölést. Az „a” és „b” közötti szerkezeti különbségek mind a négy párnál feltételezhetően egyformák. Ahogy várható volt, még a nagyobb C—076 vegyületeket sem állítjuk elő egyenlő mennyiségben a fermentálással. Általában azt találtuk, hogy az Ál vegyületek 20—30 súly%-át teszik ki az előállított C-076 komplexnek, az A2 vegyületek mintegy 1—20%-át és a B1 és B2 vegyületek mindegyike mintegy 25-35%-át. Az „a” sorozat vegyületeinek és a „b” sorozat vegyületeinek súlyaránya 85 : : 15-99 :1. A C—076 vegyület sorozat elválasztása a fermentlétől és az egyes vegyületek kinyerése oldószeres extrakcióval és kromatográfiás frakcionálással történik különböző kromatográfiás módszerek és oldószer rendszerek segítségével. A C—076 vegyületek kevéssé oldódnak vízben, azonban szerves oldószerben jól oldódnak. Ezt a tulajdonságot kihasználhatjuk a vegyületek kinyerésére a fermentléből. így az egyik kinyerési mód szerint az egész fermentlevet leszűrjük és a vizes szűrletet eltávolítjuk. A nedves micélium kalácsot megfelelő szerves oldószenei extraháljuk. Akármelyik szerves oldószert alkalmazhatjuk, előnyösen azonban vízzel elegyedő oldószert, például acetont, metanolt, etanolt, stb. használunk. Általában több extrakcióra van szükség a maximális kinyerés eléréséhez. Az oldószerrel a C-076 aktív anyagokat és más parazita ellenes hatással nem rendelkező C-076 anyagokat is elkülönítjük. Ha az oldószer vízzel elegyedő, a vizet is eltávolítjuk a nedves micéliumokból. Az extrahált micéliumokat már nem kell megőrizni. Az oldószeres extraktumokat elpárologtatjuk, így eltávolítjuk a szerves oldószert és többször extraháljuk egy második oldószerrel. Ha az első extrakdó során vízzel elegyedő oldószert használunk, a második extrakdó előnyösen vízzel nem elegyedő oldószerrel, például kloroformmal, metilénkloriddal, széntetrakloriddal, etilacetáttal, metiletil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
