179041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-076 vegyületek és azokat tartalmazó féregírtószerek előállítására
23 179041 24 3 liter kloroformos oldatot kloroformmal töltött 2400 g szilikagélen (Davidson Grade 62) kromatografálunk. A 9,5 x 122 cm-es oszlopot nyolc 3800 ml-es kloroform adaggal (1-8 frakció), majd nyolc 3800 ml-es kloroform/metanol 49 :1 arányú 5 elegy adaggal (9-16 frakció) hívjuk elő. Az egyes frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával elemezzük (szilikagél lemezek, Ouanta/Gram GIF) és kloroform és metanol 19 : 1 arányú elegyével hívjuk elő. A 9-11., 12-13. és 14. frakciókat szárazra pároljuk és így a 9—11. frakcióban 6,63 g C-076 A komponenst, a 12-13. frakcióban 24,91 g C-076 B-t és a 14. frakcióban 4,71 g C—076 B komponenst kapunk. A 12-14. frakcióknál kapott anyagokat (29,62 g) 15 egyesítjük és 100 ml metilénkloridban oldjuk, 400 g szilikagélen (Davidson Grade 62) metilénkloridban kromatografáljuk. Az oszlopot 1500 ml metilénklorid/2-propanol 20 99:1 arányú, 1500 ml metilénklorid/2-propanol 49 :1 arányú, 2000 ml metilénklorid/2-propanol 19 :1 arányú és 1000 ml metilénklorid/2-propanol 9 :1 arányú elegyével eluáljuk. 2,56 g 5500— —6000 ml térfogatú és 6000—6500 ml (5,03 g) 25 eluátumot egyesítünk 25 ml metilénkloridban és 60 g szilikagélen kromatografáljuk hexánban. Először 70 ml hexánt és 100 ml hexán-dietiléter =4:1 arányú elegyet fogunk fel, majd az oszlopot 600 ml hexán-dietiléterrel (1:4) hívjuk elő, és 200 ml-es 30 frakciókat szedünk, végül 700 ml éterrel eluálunk és 100 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopról eluált 400—600 ml-ből 2,035 g C—076 B1 komponenst kapunk. A 600-1100 ml 0,881 g C-076 B1/B2 komponens elegyet tartalmaz és az 1100—1500 ml 35 0,381 g C-076 B2 komponens elegyet tartalmaz. A C-076 B1/B2 elegyet 4,2 ml metilalkohol és víz 4 :1 arányú elegyében oldjuk és C18 Porasil/Bondapak 37-75 mikron méretű oszlopon kro- 40 matografáljuk ugyanabban az oldószerben. A fordított fázisú nagy nyomású 1,2 mx 16 mm méretű oszlopot, amelynél a polárosabb komponensek eluálódnak először 800 ml/óra sebességgel eluáljuk és 21.3 ml-es frakciókat szedünk. A C-076 vegyületek 45 jelenlétét a frakciók ultraibolya abszorpciójának megfigyelésével követjük. AC—076 B2-t a 24—37 frakciókból és a C-076 B 1-t az 51—70 frakciókból izoláljuk. 195,4 mg C—076 B2-t és 137 mg C—076 Bl-t kapunk. A mintákat ezután 4g-os szilikagél so oszlopokon (Davidson Grade 62) metilénkloridban egyenként kromatografáljuk. Az oszlopokat 35 ml metilénklorid és metanol 9 :1 arányú elegyével eluáljuk. Az egyes oszlopokról lefolyó utolsó 20 ml eluátumot összegyűjtjük és szárazra pároljuk, 55 155.3 mg C-076 B2 és 90 mg C-076 Bl-t kapunk. Ezután 50 mg C—076 Bl-t és 100 mg C—076 B2-t preparatív szilikagél lemezeken (Analtech HF 254) kromatografáljuk, hexán 12%-os izopropanolos oldatával, majd éténél hívjuk elő, és lényegében 60 tiszta C—076 Bl-t és C—076 B2-t kapunk. Az így kinyert C—076 B1 és C—076 B2 infravörös abszorpciós színképét a 3. és 4. ábra mutatja. A C-076 B2 nukleáris mágneses rezonancia spektrumát a 8. ábra mutatja. 65 6. példa 50 ml következő összetételű táptalajt tartalmazó 250 ml Erlenmeyer lombikot beoltjuk Streptomyces avermitilis MA 4848 megfagyott ampullájának tartalmával. Laktóz 2,0% Desztillációs maradék 1,5% Autolizált élesztő, Ardamin pH 0,5% pH sterilizálás előtt 7,0 és 150 percenkénti fordulatszámú rotációs forgóberendezésen inkubáljuk 28 °C-on 24 óra hosszat. A fenti fermentációs táptalajból 10 ml-t arra használunk, hogy beoltsunk vele egy 2 literes Erlenmeyer lombikban levő 500 ml azonos összetételű táptalajt. A femrentációs táptalajt 150 percenkénti fordulatszámú rotációs rázóberendezésen 28 °C-on 24 óráig inkubáljuk. A fenti táptalajokkal beoltunk egy 756 literes rozsdamentes acél fermentorban levő 467 liter következő összetételű táptalajt : Laktóz 2,0% Desztillációs maradék 1,5% Autolizált élesztő, Ardamin pH 0,5% Polyglycol 2000 0,32 ml/liter pH sterilizálás előtt 7,0 A fermentációs táptalajt 28 °C-on 40 óráig inkubáljuk 10 láb3/perc levegőáramlási sebességgel és 130 percenkénti fordulatszámú keverési sebességgel. A fenti táptalaj 230 literével beoltunk egy 5,670 literes rozsdamentes acélfermentorban levő 4310 liter következő összetételű táptalajt : Dextróz 4,5% Peptonizált tej 2,4% Autolizált élesztő, Ardamin pH 0,25% Polyglycol 2000 2,5 ml/liter pH sterilizálás előtt 7,0 A fermentációt 144 óráig folytatjuk 26 °C-on, a levegő áramlási sebessége 54,3 láb3/perc és a keverési sebesség 120 fordulat/perc. A fermentléket leszűrjük és a micéliális szűrési kalácsot mintegy 1500 liter acetonnal körülbelül 1 óra hosszat keverjük és leszűrjük. A szűrési kalácsot 150 liter aceton és 40 liter ionmentes víz elegyével mossuk és így 2000 liter extraktumot kapunk. A fenti fermentálással és extrahálással azonos méretekben további 2000 literes acetonos extraktumot kapunk és az első extraktummal összeöntjük és mintegy 800 liter térfogatra pároljuk be. A koncentrátum pH-ját koncentrált sósav hozzáadásával körülbelül 4,7-re állítjuk be és 800 liter metilénkloriddal öntjük össze. Az egyesített oldószereket mintegy 4 óráig kevertetjük és elválasztjuk. A vizes réteget még 800 liter metilénkloriddal öntjük össze és 4 órát kevertetjük. A fázisokat elválasztjuk és az egyes metilénkloridos extraktumokat külön kezeljük 10 kg Super-Cellel és leszűrjük. À két kivonatot összesen mintegy 60 liter térfogatúra koncentráljuk. 12
