179013. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-35512 antibiotikum-keverék előállítására
43 179013 44 son kivitelezett desztillációval 150ml térfogatra töményítjük az oldatot, fagyasztva szárítjuk, amikor 5,3 g tisztított A-35 512 C dihidrogénkloridot kapunk. Az A-35 512 C dihidrogénklorid só végső tisztítását 5 x 41 cm méretű savas alumíniumoxidból (Woelm) készült kromatografáló oszlopon végezzük. Az oszlopot 50%-os vizes metanollal töltjük és tisztítjuk. Amikor a mosófolyadék tiszta lesz, az 5,3 g, 30 ml 50%-os vizes metanolban oldott A—35 512 C komponenst rátöltjük az oszlopra. A kromatografálást 50%-os vizes metanollal végezzük, 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett. 12 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, ezeket vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk, ahogy azt az előzőekben ismertettük. A 22-74. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson 250 ml térfogatra töményítjük, fagyasztva szárítjuk, amikor 3,86 g A-35 512 C dihidrogénkloridot kapunk. 11. példa Az A-35 512 C komponens ionos klórtól mentes alakjának előállítása A 10. példában megadottak szerint előállított A-35 512 C dihidrogénklorid só 200 mg-ját enyhén bázikus ioncserélő gyantán, a 9. példában megadott eljárást megismételve kromatografáljuk. Ily módon 156 mg ionos klórtól mentes A—35 512 C komponenst kapunk. Ez az ionos klórtól mentes A—35 512 C komponens közelítőleg 1,90% klórt tartalmaz. 12. példa Az A—35 512 E komponens tisztítása Az 5. példában megadott eljárással előállított (32—44. frakciók) részlegesen tisztított, 8,1 g A—35 512 E hidrogénkloridot 40 ml ionmentes vízben oldjuk. Az oldatot 5 x 110 cm, egy éjszakán át vízzel mosott poliamid (MN, szemcseméret kisebb mint 0,07 mm, Brinkman Instruments Inc.) oszlopra töltjük. Ionmentes, 20 ml/15 perc sebességgel áramló vízzel eluáljuk az oszlopot, miközben 20 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 118. frakciónál az eluálást 50%-os vizes metanollal folytatjuk. A frakciókat a 10. példában megadottak szerint vékonyrétegkromatográfrával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk. Az A-35 512 E komponenst a 148—195. frakciók tartalmazzák. Ezeket egyesítjük, csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval 150 ml térfogatra töményítjük, fagyasztva szárítjuk, amiután 2,7 g A—35 512 E hidrogénkloridot kapunk. 615 mg ily módon részlegesen tisztított A-35 512 E hidrogénklorid sót 5 ml 50%-os vizes metanolban oldunk, az oldatot 1,5 x 50 cm méretű savas alumíniumoxid (Woelm) kromatografáló oszlopra töltjük, amelyet 50%-os vizes metanollal készítettünk, és addig mostunk, amíg az effluens tiszta nem lett. 50%-os vizes metanollal eluáljuk az oszlopot, az eluálás sebessége 1 ml/perc. Az összegyűjtött frakciók térfogata 10 ml. Az egyes frakciókat ismét vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk. Az 5-8. frakciót egyesítjük, és csökkentett nyomáson 10 ml térfogatra töményítjük. 50 ml ionmentes vizet adunk a sűrítményhez, a kapott oldatot fagyasztva szárítjuk, amikor 480 mg A-35 512 E hidrogénkloridot kapunk. 13. példa Ionos klórtól mentes A—35 512 E előállítása A 12. példában megadottak értelmében előállított A—35 512 E hidrogénklorid só 200 mg-ját a 9. példában megadott eljárást megismételve enyhén bázikus ioncserélő gyantán kromatografáljuk. Ily módon 170 mg ionos klórtól mentes A—35 512 E komponenst kapunk. Ez az ionos klórtól mentes A—35 512 E közelítőleg 1,72% klórt tartalmaz. 14. példa Az A—35 512 H komponens tisztítása Az 5. példában megadottak szerint előállított (1—10. frakciók) részlegesen tisztított, 30 g A—35 512 H hidrogénklorid sót metanol és víz 7 :3 arányú elegyének lehető legkisebb mennyiségében oldjuk. Az oldatot savas alumíniumoxid oszlopra (3 x 60 cm, Woelm, metanollal töltjük fel és addig mossuk ugyanezzel az oldószerrel, amíg effluens tiszta nem lesz) töltjük. Ezután 4 ml/perc átfolyási sebességgel metanollal eluáljuk az oszlopot. Az összegyűjtött frakciók térfogata egyenként 24 ml. Az 59. frakció után metanol és víz 1:1 arányú elegyével folytatjuk az eluálást. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk, az eluálást kloroform : metanol : ammóniumhidroxid 2:3:1 arányú elegyével végezzük, teszt-mikroorganizmusként Bacillus subtilis-t használunk (a pH lúgos). Az 51-118 frakciókat egyesítjük, az oldatot csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként 6,4 g tiszta A—35 512 H hidrogénkloridot kapunk. 15. példa Ionos klórtól mentes A—35 512 H komponens előállítása A 14. példában megadottak szerint előállított A—35 512 H hidrogénklorid só 200 milligrammnyi mennyiségét enyhén bázikus ioncserélő gyantán kromatografáljuk az eljárást a 9. példában megadottak szerint végezzük. Ily módon 143 mg ionos klórtól mentes A-35 512 H komponenst kapunk. Ez az ionos klórtól mentes A—35 512 H komponens körülbelül 1,59% klórt tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
