178808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-mono-foszfát-származékok előállítására
5 178808 6 szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, és a maradékot 3 ml metanolban oldjuk. A metanolos oldatot teflonnal bélelt rozsdamentes acél bombacsőbe töltjük, és hozzáadunk 8 ml, ammóniagázzal a jeges fürdő hőmérsékletén telített metanolt is. A lezárt bombacsövet 122 °C hőmérsékletű kemencében tartjuk 4 órán át, majd lehűtjük és kinyitjuk. Az oldószer legnagyobb részét lepároljuk, és a visszamaradó reakcióelegyből Eastman Chromatogram!R) cellulóz vékony-réíegkromatográfiás lemezre cseppentünk fel. Futtató elegyként n-propanol és víz 70 : 30 térfogatarányú elegy ét alkalmazzuk,, A 0,16 és 0,34 Rf értékeknél megjelenő foltokat kivágjuk, 0,6 ml pH = 8 értékű trisz pufferoldatban [trisz(hidroximetil)-aminometán] szuszpendáljuk, és a cellulózt szűréssel eltávolítjuk. A kromatogramban megjelenő foltok 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-monofoszfátot, illetve 2-klór-9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-hipoxantin-monofoszfátot tartalmaznak. Ezt olyan módon mutathatjuk ki, hogy alkálikus foszfatázzal enzimes defoszforilezésnek vetjük alá a foltokat, amikor is 9-(2- -hidroxi-etoxi-metil)-guanint, illetve 2-klór-9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-hipoxantint kapunk. Escherichia coli tenyészetből kinyert 2 mikroliter alkálikus foszfatázt hozzáadunk a szűrlethez, és az elegyet 32 °C-on 2 órán át hevítjük. Ezután vékony-rétegkromatográfiásan vizsgáljuk Eastman Chromatogram(R) cellulóz lemezeken, három oldószerrendszerrel végezve a futtatást: (a) n-propanol és víz 70 :30 térfogatarányú elegye (b) víz (c) n-propanol, tömény ammónium4iidroxid és víz 60 : 30 :10 térfogatarányű elegye. Mindegyik futtató-elegy alkalmazásakor két folt jelent meg, az egyikük 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guaninnak (A), a másikuk pedig 2-klór-9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-hipoxantinnak (B) felelt meg. Futtató oldószer Rf(A) Rf(B) Reakciótermék Rf értéke (a) 0,54 0,64 0,51 és 0,65 (b) 0,68 0,97 0,67 és 0,97 (c) 0,51 0,71 0,51 és 0,71 [A 9 - ( 2 - hi droxi-e toxi-metil)-guaninin-monofoszfát 210 °C körül kezd bomlani.] 2. példa 9-(2-Hidroxi-etoxi-metil)-guaninin-monofoszfát 0,225 g 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guaninin és 5 ml trietil-foszfát elegyét —10 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 0,76 ml foszfor-oxi-kloridot. Hagyjuk, hogy a reakcióelegy 30 perc alatt 0 °C-ra melegedjen, és 2 órán át tartjuk ezen a hőmérsékleten. Az elegyet ezután jég és víz elegyébe öntjük, és a pH értékét 2 n kálium-hidroxid oldattal 7-re állítjuk be. A kapott oldatot kloroformmal kétszer extraháljuk, majd éterrel egyszer kirázzuk. A visszamaradó vizes oldat pH-értékét 2n kálium-hidroxid oldattal 7,1-re állítjuk be, és liofílizáljuk. A kapott fehér, szilárd anyagot 7 ml vízben oldjuk, és 7 ml metanol hozzáadásával leválasztjuk a szervetlen sókat, amelyeket szűréssel eltávolítunk. A szűrlethez 70 ml acetont adunk, ekkor fehér, ragacsos anyag válik ki, amelyet 7 rn) vízben oldunk, 7 ml etanolt adunk hozzá, és az elegyet szűrjük. Nagy feleslegben vett (70 ml) acetont adunk hozzá, ilyen módon ismét kicsapva a ragacsos anyagot, amelyet körülbelül 20 ml etanolban oldunk. Az oldószert gyorsan lepároljuk, és 2,6 g fehér porszerü anyag marad vissza, amely szervetlen sók és a kívánt foszfát keveréke. A szilárd anyagot 10 ml vízben oldjuk, Bio-Gel P—2 oszlopra (200-400-as szitaméretű, töltet 2,7 x 90 cm méretű oszlop) visszük fel, és vízzel eluáljuk. 166 ml eluátum összegyűjtése után a monofoszfát legnagyobb része 50 ml oldattérfogattal eluálható, amint azt az Eastman Chromatogram!R) cellulóz lemezen végzett vékony-rétegkromatográfiás vizsgálat mutatja: futtató elegy n-propanol és víz 70 :30 térfogatarányú elegye, a 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-foszfát Rf értéke pedig 0,11. Az eluátumot liofílizáljuk, és ilyen módon 0,28 g szilárd anyagot kapunk, amely az ultraibolya spektroszkópiás vizsgálat alapján 0,2 g monofoszfátot tartalmaz. A termék 210 °C-on kezd bomlani. 3. példa 9-(2-Hidroxi-etoxi-metil)-guanin-monofoszfát-ammóniumsó 0,28 g 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-foszfátot 30 ml vízben oldunk, és az oldat savasságát 6-os pH-értékre állítjuk be 6n sósavoldattal. A terméket 14 ml aktív szénnel adszorbeáljuk, (Fischer 5-690B, 50—200-as szitaméretű, savval mosott és toluollal dezaktívált aktív szén), vízzel jól átmossuk és 2% tömény ammónium-hidroxidot tartalmazó 70 ml 50%-os vizes etanollal eluáljuk. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, és ilyen módon 0,048 g 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-monofoszfát-ammóniumsót kapunk. Rf értéke 0,30 Eastman Chromatogram!R) cellulóz lemezen (futtató elegy n-propanol és víz 70 : 30 térfogatarányú elegye). A termék 210 °C-on kezd bomlani! , 4. példa Tabletta 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin--foszfát-nátriumsó 100 mg Laktóz 200 mg Keményítő 50 mg Poliviml-pirrolidon 5 mg Magnézium-sztearát 4 mg 1 db tabletta súlya 359 mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
