178485. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antitestek immobilizálására akrilamid alapú polimermátrixban hormonok és gyógyszerek radioimmunlógiai meghatározásánál
5 178485 6 1. példa Ebben a példában a polimermátrixnak östrioI-3- -glukuronid és östriol-3-szulfát keresztreakciójára (K) gyakorolt hatását mutatjuk meg. 5 A K keresztreakciót úgy számítjuk, hogy a megfelelő haptén y = 50-hez szükséges tömegét elosztjuk a keresztreakcióban résztvevő haptén y=-50-hez szükséges tömegével, és az így kapott értéket megszorozzuk 100-zal. Az értéket az ID5 alapján szá-10 móljuk. A kiválasztott antiöstriolantitest a 3-glukuronidkonjugátumok illetve 3-szulfát-konjugátumok nagy keresztreakcióját mutatta. Minden polimerizációs reakcióelegynél úgy állí-15 tottuk be a koncentrációt, hogy az összes monomerkoncentráció 2,9 mól/liter legyen. A reakcióelegyet például úgy készítettük el, hogy 5 g akrilamidot és 1,25 g N,N’-me tilén hiszakrilamidot főzőpohárban feloldottunk 24 ml 7,2 pH értékű foszfát-pufferben. 20 Ezután hozzákeverünk a reakcióelegyhez az antitestnek 1 ml foszfátpufferban készített oldatát, és 0,15 mg riboflavinnal és 0,10 ml N,N,N,’N-tetrametüetüéndiaminnal megindítottuk a reakciót és a reakcióelegyet ultraibolya fénnyel sugároztuk be. A 45 perc ideig tartó besugárzási idő alatt a hőmérsékletet 50 °C alatt tartottuk. Az így kapott géltömböt aprítottuk, desztillált vízzel mostuk és szárítottuk. Kis hengerbe bemértünk 22 mg száraz antiöstriolantitestet és rávittük 0,150 ml inkubációs oldatot. Az inkubációs-oldat 2 3H-östriolt és nem jelölt haptént (Östriol, östrid-3-glukuronid vagy östriol-3-szulfát) tartalmazott. A reakció hőmérsékletét 0 °C-on tartottuk. 30 perc inkubációs idő elteltével választottuk el a szabad, antitest által kötött haptént elúdóval az albumin-tartalmú foszfát-puffertól. Az eluátumot szcintillációs üvegekbe fogtuk fel, hozzáadtunk 15 ml szcintillációs folyadékot és mértük folyadék-szcintillátorban a radioaktivitás mértékét. Az impulzusok alapján a szabad 3H-östriol indikátorhaptén koncentrációját számoltuk. A vizes rendszerben, illetve az akrilamid valamint akrilamidkopolimer-mátrixok alkalmazásával kapott eredményeket az 1. táblázat mutatja. A megadott értékek az előzőekben definiált keresztreakdó értékek. 1. táblázat Vizes Akrüamid Akrilsav/ Akrilamid Metakrilsav/akrilamid rendszer nátrium-sója nátrium-sója 100 10 :90 30 :70 50 : 50 20 : 80 40 : 60 60 : 40 östriol-3-glukoronid 61 29 19 10 14 14 4 21 östriol-3-szulfát 47 33 30 12 24 27 6 23 Az eredmények alapján látható, hogy kopolimerizátumok alkalmazása esetén a vizes rendszerhez és az akrilamid homopolimerizátumhoz viszonyítva a kötésfajlagosság jelentősen megnő. A kopolimeri- 45 zátum megfelelő kiválasztásával a fajlagosság növekedése a vizes rendszerhez képest 15-szörös, az akrilamid homopolimerizátumhoz képest 7-szeres. Ezt láthatjuk, ha a 40/60 részarányban metakrilsavat és akrilamidot tartalmazó kopdimer alkalmazása esetén 50 kapott értékeket összehasonlítjuk a vizes rendszer és az akrilamid homopdimerizátum alkalmazása esetén kapott értékekkel. 2. példa Ez a példa a találmány szerinti pdimermátrix thyroxinnak pepszin enzimatikus hidrolízise segítségével történő összme^iatározásánál való alkalmazd- 60 sát mutatja. Az antitest-gél polimermátrixa akrüamidból és 40 mól% metakrilsav-nátriumsót tartalmazó kopolimerizátumból állt, melyet 20%os monomer-ddatban állítottunk elő. 65 10 jul szérumot, melynek 100 ml-e 18pg thyroxint tartalmazott, az enzim-oldat 160/il-vel kevertünk össze, mely 0,1 n sósav-oldatban milliliterenként 2 mg pepsint tartalmazott. Az enzimmel történő reakciót szobahőmérsékleten 30 perc ideig folytattuk le. Ehhez a 170 ml reakcióelegyhez ezután 150 ml nyomjelző-izotópos oldatot adtunk, mely milliliterenként 5,2 mg radioaktívan jelzett thyroxint tartalmazott. Ezután az egész reakcióelegyet felvittük 60 mg antitest-gélre. Az inkubádós idő 30 perc volt, a hőmérséklet pedig 22 °C. A kiértékelés alapján a pontosság rendkívül nagy, 98%. 3. példa Ez a példa a találmány szerinti polimermátrix cortisol összmeghatározásánál való alkalmazását szemlélteti. Az antitest-gél polimermátrixa akrüamidból és 40 mól% metakrilsav-nátrium-és-kaldum-sójának ke-3
