178405. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergornin és béta-ergokriptin fermentációs előállítására
5 178405 6 hoz képest, mely félszintézis csak a peptid-rész szintézisét oldja meg, a lizergsav részt változatlanul fermentativ úton kell előállítani. 3. A törzs gyakorlatilag csak az argotoxin komponenseit termeli, a kevés ergometrin vízoldható lévén könynyen eltávolítható az ergotoxin gyártás szempontjából számbajöhető peptidalkaloidok mellől. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa MNG 00186 számon deponált Claviceps purpurea variáns törzs St agar-táptalajon nőtt tenyészetét 500 ml-es Erlenmayer lombikban levő 100 ml KG táptalajra oltjuk, majd 24 °C hőmérsékleten 300-as löketszámú rázóasztalon 4 napig inkubáljuk. Az így kapott tenyészet 10—10 ml-ét tovább oltjuk 8 db 100—100 ml St táptalajt tartalmazó lombikba, és a tenyészeteket 7 napon át 24 °C hőmérsékleten, rázott kultúrában a fent leírt körülmények között fermentáljuk. Négy lombikhoz nem adunk prekurzort, 4 lombikhoz pedig prekurzorként a fermentáció kezdetén 0,2 g valint adunk. A 7. napon a fermentációt leállítjuk, és a kontroll (prekurzor nélküli) fermentleveket egyesítjük és alkaloid tartalmukat meghatározzuk. Átlagos ergokomin-tartalom 80 y/ml, az a-ergokriptin-tartalom 15 y/ml és a ß-ergokriptin-tartalom 30 y/ml. A prekurzor adagolással készült fermentleveket szintén egyesítjük és alkaloid-tartalmukat meghatározzuk. Átlagos ergokornin-tartalom 250 y/ml, az a-ergokriptintartalom 25 y/ml és a ß-ergokriptin-tartalom 30 y/ml. A példában alkalmazott táptalajok : GK táptalaj tripkazin 7,0 g citromsav 4,1 g káliumdihidrogénfoszfát 0,3 g magnéziumszulfát 0,3 g ammóniumhidroxid ad pH 5,7—5,8 víz ad 840 ml A táptalajt 84 vagy 840 ml-enként lombikba töltjük és lombikonként 16, illetve 160 ml 50%-os glukózoldatot adunk hozzá sterilen. St táptalaj szacharóz 100,0 g borostyánkősav 10,0 g káliumdihidrogénfoszfát 0,25 g magnéziumszulfát 0,25 g ammóniumnitrát 1,0 g kalciumklorid 1,0 g ammóniumhidroxid ad pH 5,2—5,3 víz ad 1000 ml A táptalajt 100 ml-es adagokban Erlenmayer lombikban vagy 100 literes mennyiségben félüzemi fermentorban sterilezzük. Az St-agar-táptalaj (Blake) annyiban különbözik az St folyékony táptalajtól, hogy ahhoz literenként 25 g agar-port (Difco) is adunk, és a táptalajt az agar hozzáadása után felfőzzük, majd 150 ml-es adagokban palackokban sterilezzük. 2. példa MNG 00186 számon deponált Claviceps purpurea variáns St agar táptalajon nőtt tipikus, 20 napos telepét az agar felületéről leválasztjuk, 20 ml fiziológiás steril konyhasóoldattal homogenizáljuk, majd a szuszpenzió 10 ml-ét 100 ml, 500 ml-es Erlenmayer lombikban elősterilezett St táptalajra oldjuk. 6 napos, 24 °C hőmérsékleten rázóasztalon történő tenyésztés után a tenyészetet 100 ml, 500 ml-es Erlenmayer lombikban előkészített TC—54 jelű táptalajra oltjuk, majd 3 napos rázatás után a tenyészetet ismét 100 ml, 500 ml-es Erlenmayer lombikban sterilezett St táptalajra oldjuk. Az oltásra használt tenyészet mennyisége 10 ml. A tenyésztést fenti körülmények között, rázóasztalon 7 napig folytatjuk. A kapott alkaloidszintek a következők : Ergokomin 150 y/ml, a-ergokriptin 40 y/ml és ß-ergokriptin 90 y/ml. A példákban alkalmazott táptalajok közül a folyékony St táptalaj, valamint az St agar táptalaj (Blake) összetételét az 1. példában megadtuk. A TC—54 táptalaj összetétele a következő: szacharóz 100,0g citromsav 10,0 g nátriumklorid 10,0 g káliumdihidrogénfoszfát 0,5 g magnéziumszulfát pH beállítás ammóniumhidroxiddal pH 5,7—5,8 értékre 0,5 g víz ad 1000,0 ml Megfelelő mennyiségű táptalajt készítünk, és 100 ml-enként 500 ml-es Erlenmayer lombikban, illetve 10 litert 15 literes laboratóriumi fermentorban sterilezőnk. 3. példa MNG 00186 számon deponált Claviceps purpurea variáns St agar táptalajon (Blake) terített 25 napos tenyészetét az agar felületéről kaparással elválasztjuk és 100 ml fiziológiás konyhasó oldattal homogenizáljuk. Az így kapott szuszpenziót 3 literes Erlenmayer lombikban elősterilezett 1 liter GK táptalajra oltjuk. A tenyészetet 24 °C hőmérsékleten 44 óra hosszat rázatjuk. Az így nyert tenyészettel 15 literes össztérfogatú laboratóriumi fermentorban levő 10 liter TC—54 jelű táptalajt oltunk. A fermentációt 0,25 liter/Iiter/perc levegő átáramoltatása közben 24 °C-on, 240/perc fordulatszámú keverés közben három napig folytatjuk, majd a tenyészettel 150 literes össztérfogatú, saválló laborfermentorban elősterilezett 100 liter St táptalajt oltunk. A tenyésztést 22 °C-on 0,35 liter/liter/perc levegő átáramoltatása, és 150/perc fordulatszámú keverés közben hat napig folytatjuk. A fermentáció 2., 3. és 5. napján ecetenként 100—100 g valint és 20—20 g izoleucint adunk a fermentléhez. Hat nap fermentáció után a fermentlé 320 y/ml ergokomint, 60 y/ml a-ergokriptint és 160 y/ml ß-ergokriptint tartalmaz. A példákban alkalmazott táptalajok összetételét az 1. és 2. példában ismertettük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
