178347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok előállítására
7 178347 8 seggel szivattyúzzuk ki, hogy így a térfogatot állandó értéken tartsuk az edényben. A felhasznált táptalaj az alábbi összetételű: Komponens: Koncentráció (mmól): (NH4)2S04 11,0 HjP04 10,0 MgS04 0,4 CaCl2 0,1 FeS04 33 x 10“2 3 ZnS04 l,0xl0“3 MnS04 1,0 x 10“ 3 h3bo3 l,0x 10“3 CuS04 0,5 xlO“3 Na2Mo04 0,2x 10“3 CoCI2 0,2x 10“3 KI 0,5 xlO“3 h2so4 l,0x 10“3 A fermentort megtöltjük 2 liter táptalajjal, keverjük, levegőztetjük, és a fentiekben ismertetett módon metánt és levegőt vezetünk bele. Mindegyik fermentort inokuláljuk a teljesen kifejlett, rázott kultúra 100 ml-ével, az egyik esetben a T4 vegyes, a másikban a Methylococcus 999 tiszta kultúráját használva. A közeget különböző hígltási sebességekkel adagoljuk a fermentorokba, 0,10 óra-1 sebességgel kezdve, és körülbelül 0. 02 0,03 óra 1 lépésekben növelve a sebességet mindaddig, míg a kultúra kimosódása megindul. Minden higitási sebességnél állandó állapotokat érünk cl. körülbelül 48 órán keresztül. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az alkalmazott táptalaj összetétele: KH2P04: 1,60 g/liter; Na2HP04: 1,16 g/liter; MyS04.7H20 g/liter: 0,080; FeS04.7H20: 0,014 g/liter; Ca(N03)2.4 H20: 0,025 g/liter; 2,4x10“3 g/liter; ZnS04.7 H20: 3,4x 5 x 10“4 * g/liter; MnS04.4H20: 3,0 xlO“6 g/liter; NaMo04.2 H20: 2,4xl0“4 g/liter; CoC12.6H20: 1,5 xlO“4 g/liter, és 0,33 ml/liter 36 n tömény kénsav. Nitrogénforrásként 3,18 g liter“1 NaNOj-ot, 2,46 g/liter“1 (NH4)2S04-ot vagy 1,122 g/liter“1 karbami- 10 dot használunk. Az eredményeket a következő, 2. táblázat tartalmazza: 2. táblázat 15 A nitrogénforrás hatása és növekedés-limitáló tényező a T4 vegyes kultúra folyamatos kultúráin Nitrogénforrás: NaN03 (NH4)2S04 karba-2o mid Levegő/metán aránya a bevezetett gázban Növekedés-Ii-3: 1 6: 1 3: 1 6: 1 3: 1 25 mitáló faktor: Kihozatali o2 ch4 o2 ch4 o2 koefficiens: 0,65 0,63 0,69 0,83 0,76 9 sejt/g CH4 ±0,03 ±0,03 ±0,04 ±0,02 ±0,05 30 4. példa Kultur.I T4 Mcthylococcus 999 2. példa A T4 jelzésű vegyes kultúrát különböző nitrogénforrások felhasználásával, különböző körülmények között tenyésztjük. A kultúrákat az I. példában ismertetett módon 2,5 liter térfogatú, kevert edényekben tenyésztjük. A tenyészet mikrobiológiai jellemzői nem változnak e kísérletek során. A tenyésztés körülményei a következők : hőmérséklet : 42 C: pH: 7,0; higitási sebesség: 600 ml/perc. A kihozatali hányadosokat a fermentorba beáramló és onnan kiáramló gáz gáz-kromatográfiás analízissel meghatározott összetételéből és a gáz áramlási sebességek buborékos áramlásmérővel végzett gondos mérésekből megkapott értékeiből határozzuk meg. A száraz súlyra számított koncentráció meghatározása úgy történik, hogy megbecsüljük a különbséget a kultúra minta és a kultúra szupernatáns szén-koncentrációja között egy 6000 g-os minta 15 percen át végzett centrifugálása útján. A kályhában szárított sejtek széntartalma 48%-nál konstans értéket vesz fel. 1. táblázat Ma*imAlia elért higitási sebesség (óra ■') Koncentráció száraz súlyra számítva [g/l] 0.34 I 2,42 I 0.31 I 2,14 Kihozatali koefficiens [g száraz súly/gCH4] 0,71 0,66 A kultúrát egy 7 literes, kevert fermentorban (Chemap Co. Ltd., Zürich, Svájc) tenyésztjük. A hőmérsékletet 35 42 °C-on, a pH-értéket pedig kálium-hidroxid és nátrium-hidroxid 1: 1 arányú, 5 n elegyének vagy 5 n kénsav-oldatnak automatikus adagolásával 7,4-en tartjuk. Metán és oxigén elegyét vezetjük a fermentorba 2 liter/perc sebességgel. A fermentort 1500 fordulat/perc 40 sebességgel keverjük, és a térfogatot állandóan 4,4 liter értéken tartjuk az edényben úgy, hogy a kultúrát folyamatosan szivattyúzzuk. A táptalajt két részletben adjuk a kultúrához: 1. 150 mm ól NH4S04, 45 mmól H3P04, 4,5 mmól 45 MgS04, 15, mmól CaCl2, 0,6 mmól FeS04 és egy olyan oldat, mely 0,18 g/liter ZnS04.7 HzO-t, 0,16 g/liter CuS04.5 H20-t, 0,15 g/liter MnS04.4 H20-t. 0,18 g/liter CoCl3.6 HzO-t, 0,1 g/liter H3B03-t, valamint 0,3 g/liter NaMo04.2 H20-t tartalmaz és 50 2. deionizált víz. A fenti összetevőket folyamatosan szivattyúzzuk a kultúrába úgy, hogy a teljes áramlási sebesség mindig 0,09 óra“1 higitási sebességnek feleljen meg. A sók és a vizáram relatív áramlási sebességei változnak. Mivel a 55 beadagolt gázmennyiség feleslegben van, a kultúra koncentrációját a táptalaj teljes mennyiségében jelenlevő nitrogénforrás mennyisége limitálja. Ennek megfelelően, növelve a sóoldat adagolásának sebességét a víz adagolási sebességéhez képest, nő a kultúrában a 60 mikroorganizmus koncentráció. A kiindulási helyzetben a mikroorganizmus koncentrációja 4,2 g/liter (száraz), és a sóoldat áramlási sebességét addig növeljük, míg a koncentráció el nem éri a 23 g/liter értéket, és nem állandósul ezen az ér- 65 téken. 4
