178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
7 178052 8 lábja hatására emittált röntgensugarak energiadiszperziós analízise segítségével 290 ± 20-nak bizonyult, ez a módszer a kénatom jelenlétén alapul, amely a molekula egyetlen olyan eleme, amelynek az atomszáma 9-nél nagyobb, és amely tetemes arányban található a tienamicinben. A tienamicin empirikus képlete: CnHieN204S, amelyet nagy felbontású tömegspektrométer segítségével határoztunk meg. Az ennek az empirikus képletnek az alapján számított elemi összetétel a következő: C = 48,52%, H = 5,92%, N = 10,29%, 0 = 23,5%,-S = 11,77%. A tienamicin IR-spektruma (1. ábra) nujolban a következő abszorpciós csúcsokat mutatta: éles csúcs 1765 cm”1-nél, széles csúcs 1650 — 1550 cm-1 -nél 2800-2500 cm”1-nél és 3500 — 3100 cm-1 -nél. Egyéb sávokat találtunk: 1290, 1245, 1150— —1130, 1065, 995, 970, 945-935, 885, 785 és 720 cm-1-nél. A nehéz vízben (D20) liofilizált tienamicin, amelyet l,5mg/0,4ml D20 koncentrációban vizsgáltunk, és amely nyomokban tartalmazta a belső standard 2,2-dimetü-2-szilapentán-5-szulfonsav-nátriumsót, 100 MHz-es NMR-vizsgálatnak vetettünk alá, és a spektrum a következő csúcsokat mutatta: 5 = 1,275, d, 3H, J = 6,8, S =3,15, m, 6H, ô=3,39, d, 1H, J = 6,0, 2,9, 5 =4,20, m, 2H. Aotienamicin fajlagos optikai forgatóképessége: [a]p7°c = +82,7 (c = 0,l súly/térfogat%, 10 millimólos vizes foszfátpuffer-oldatban, pH = 6,95. Az optikai rotációs diszperzió egyetlen, pozitív Cotton-effektust mutat, egy csúccsal 311 nm-nél és egy minimummal 242 nm-nél. A cirkuláris dikroizmus pozitív maximumot mutat 287,5 nm-nél és negatív minimumot 216 nm-nél. A tienamicin ÜV-abszorpdós spektrumát vizes oldatban határoztuk meg, pH = 4—8 tartományban csúcs mutatkozott 296,5 nm-nél (Ej^m = = 290, e = 79Ö0) és egy minimum 242 nm-nél (Ej^m = 88). pH = 2-es oldat elkészítése után azonnal. meghatározott spektrum eltolódást mutat a vörös felé, 309 nm abszorpciós maximummal. pH = 12-es oldat elkészítése után azonnal meghatározott spektrum eltolódást mutat' a vörös felé, 300,5 nm abszorpciós maximummal. A tienamicin egy belsőleg semlegesített amfoter anyag, melynek savassága: pKaj = 3,08, ha 30 millimólos foszfátpuffer-oldatban mértük, kihasználva az ultraibolya abszorpciós spektrum pH-indukát eltolódását. Pozitív szín-reakciót kaptunk ninhidriddel, jódplatináttal és Folin-féle reagenssel. Negatív Sakaguchi-próbát észleltünk. A tienamicint fluoreszkáló indikátort tartalmazó cellulóz-lapokon vékonyrétegkromatográfiának alávetve, és 70:30 arányú etanol-víz-eleggyel előhíva, úgy a meghatározott Rf-érték 0,45-0,50 volt, külön-külön mindegyik alábbi kritérium esetében: 1. bioautográfia agar lemezeken Staphylococcus aureus MB-108 (a továbbiakban Staphylococcus aureus ATCC 6538P) detektor organizmussal beoltva, 2. ráeső ultraibolya fény hatására keltett fluoreszcencia kioltása, 3. ninhidrin-spray és hevítést követően beálló őszi- Jbarackszínű reakció, 4. a jódplatinát-spray reagenssel lassú fakulása. A tienamicin mobilitása néhány további kromatográfiás rendszerben a következő: Oldószer-rendszer Adszorbens Rf-érték Butanol-ecetsav-víz (40 :10 : 50) Avicel TLC 0,43 etanol-víz (70 :30) Silica Gel G 0,49 Avicel TLC 0,48 n-propanol-víz Silica Gel G 0,31 (70 : 30) Avicel T LG 0,36 etanol-víz Whatman 1 (70 : 30) lefelémenő papírkromatogram 0,63 etanol-víz TLC Silica (70:30) Gel HF (Analtech) TLC 0,44 etanollal előmosva Az „Avicel” az American Viscose Corporation-nak a védjegye kristályos cellulózra. Az Rf-értékek megmutatják a távolságot az eredeti hely és bioakthitás közepe (amelyet bioautográfiával határoztunk meg Staphylococcus aureaus ATCC 6538P törzzsel és ezt az értéket elosztottuk az eredeti hely és az oldószer-front távolságával) között. A tienamicin savas hidrolizátumát aminosav-analízisnek vetettük alá KLA-5 Hitashi-Perkin-Elmer analizátoron, az analízis eredménye egy fő ninhidrin-reaktív komponens, amelynek retendós ideje az alaniné és a gliciné között van, ninhidrin-reakdóterméket képez, melynek 440 nm-nél mért abszorpdója háromszorosa az 540 nm-nél mértnél. Ha az antibiotikumot hideg perhangyasawal, majd hidrogénbromiddal kezeljük a savas hidrolízis előtt, oly módon, ahogy azt a reakdót arra használják, hogy tioétereket és sztilfhidrileket szulfonokká és szulfonsavakká alakítsanak, úgy az aminosav-analízis egy fő ninhidrin-reaktív komponenst mutat, amelynek retenciós ideje valamivel nagyobb az aszparaginsavnál, ninhidrin-reakdótermékének mért abszorpciója 540 nm-nél 3,2-szerese a 420 nm-nél mérténél. Ez a komponens azonos a taurinnal (2-amino-etán-szulfonsav), összehasonlítva egy autentikus minta dúdós idejével, amely autentikus mintát azonos módon oxidáltunk és savas hidrolízisnek vetettük alá. Ebből az összehasonlításból 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
