178039. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új aminoglikozid-származékok előállítására
13 178039 14 Ez a mennyiség egyébként az elérhető maximális mennyiséggel egyenlő, tekintettel arra, hogy további inkubálás már nem ad több 6-dezoxi-neomicint. Alternatív módon a nyers 6-dezoxi-neomicint tisztíthatjuk papírkromatográfiásan Whatman No. 3 MM márkanevű papíron, amikor is futtatószerként metanol és ammónium-hidroxid-oldat 4 :1 arányú elegyét használjuk. A 6-dezoxi-neomicin helyzetét úgy tesszük láthatóvá, hogy a papírt először 0,25%-os vizes nátrium-hipoklorit-oldattal, majd etanollal és ezt követően 1% oldható keményítőt és 1% kálium-jodidot tartalmazó vizes oldattal kezeljük, és az egyes kezelések között a papírt levegőn megszárítjuk. E vizsgálat során a 6-dezoxi-neomicin Rf értékét 0,30-nak találtuk. összehasonlítási célokból közöljük az ugyanezen oldószerrendszert futtatószerként használva mért Rf-értékeket neomicinre, 2-dezoxi-sztreptaminra, és 2.4- didezoxi-sztreptaminra. Rf neomicin 0,26 2-dezoxi-sztreptamin 0,58 2.4- didezoxi-sztreptamin 0,62 alacsonyabbra az utóbbi spektrumában [azaz a megfelelő értékek: m/e 255 és 372]. Ez megfelel egy trimetil-szililoxicsoport [—OSi(CH3)3] elvesztésének, illetve hidrogénatommal való helyettesí- 5 tésének. így tehát a neomicinből származó Z vegyület szerkezete megfelel a neaminénak, míg az X vegyületből származó Z vegyületé a 6-dezoxi-neaminénak. 10 Mindkét Z vegyület metanolban végzett acetilezése, majd az így kapott termék visszafdyató hűtő alkalmazásával 3 n sósavoldatban 10 órán végzett forralása útján végrehajtott savas hidrolizálása két fő terméket ad. Papír kromatográfiás vizsgálat során 15 megállapítható, hogy a két termék közül az egyik ugyanaz mind a neomicinből származó Z vegyület hidrolízise, mind az X vegyületből származó Z vegyület hidrolízise esetén. Ez az azonos hidrolízis termék nem más, mint a 2,6-diamino-2,6-didezoxi- 2o -D-glükóz. A két másik hidrolízistermék kromatográfiás vizsgálatok tanulsága szerint 2-dezoxi-sztreptamin (a neamin esetében) és 2,4-didezoxi-sztreptamin (a 6-dezoxi-neamin esetében). Ezek az eredmények egyértelműen arra enged- 25 nek következtetni, hogy az X vegyület nem más, mint a 6-dezoxineomicin. b) 6-Dezoxi-neomicin-szulfát Az a) lépésben kapott 6-dezoxi-neomicin bázis szulfátsóvá alakítható ekvivalens mennyiségű híg kénsawal végzett reagáltatás útján. A szulfátsó fajlagos forgatóképessége [a]^4 = + 43° (c=l,0, víz). c) 6-Dezoxi-neomicin szerkezete Az a) lépésben szabad bázisként kapott antibiotikum szerkezetét a megfelelő természetes antibiotikummal, azaz neomicinnel (amelyet 2-dezoxi-sztreptaminból fermentációs úton állíthatunk elő) összehasonlításban határozzuk meg. A 6-dezoxi-neomicinnek feltételezett vegyületet ezután X vegyületként fogjuk említeni. Mind a neomicin, mind az X vegyület 10%-os metanolos hidrogén-klorid-oldattal visszafolyató hűtő alkalmazásával 2 órán át végzett forralás útján végrehajtott metanolíziskor két fő terméket ad, amelyek közül az egyik mindkét esetben metil-neobioszanimid. A továbbiakban Z vegyületként nevezett másik termék a kétféle antibiotikum, vagyis a neomicin és az X vegyület esetében eltérő, éspedig a neomicinből származó Z vegyület lassabban migrai, mint az X vegyületből származó Z vegyület, ha kromatográfiásan futtatószerként metanol és ammónium-hidroxid-oldat 4 :1 arányú elegyét használva vizsgáljuk őket Mindkét Z vegyület szerkezetvizsgálatát a megfelelő per-trimetil-szilil-származékok tömegspektrometriás vizsgálatával végeztük. Bár a megfelelő molekulaionok nem állíthatók elő, a neomicinből származó Z vegyület spektruma és az X vegyületből származó Z vegyület spektruma egymáshoz nagyon hasonlóak, azonban azzal az eltéréssel, hogy az előbbi spektrumának két csúcsa [m/e 343 és 460] eltolódtak 88 tömegegységgel 2. példa 30 A 6-dezoxi-neomicin 6-dezoxi-neomicin B-re és 6-dezoxi-neomicin C-re szeparálása Az 1. példa szerint előállított 6-dezoxi-neomi- 35 cint két epimeiévé papírkromatográfiásan, futtatószerként terc-butanol, butanon, 6,5 n ammónium-hidroxid-oldat és metanol 3 :16 :6 :1 arányú elegyét használva szeparáljuk. A kapott két epimert, azaz a 6-dezoxi-neomicin B-t és C-t az előző 40 példában ismertetett módon detektálhatjuk. Whatmann 3MM márkanevű papíron metanol és ammónium-hidroxid-oldat 4 :1 arányú elegyét futtatószerként használva meghatározzuk a 6-dezoxi-neomicin B és C Rf értékeit, összehasonlítás céljából a neomicin megfelelő epimeijeinek Rf 5 értékeivel együtt. Az alábbi értékeket kapjuk. Rf 6-dezoxi-neomicin B 0,29 6-dezoxi-neomicin G 0,21 neomicin B 0,25 neomicin C 0,165 55 3. példa 6-Dezoxi-paromomicin, valamint I és II 60 epimeijeinek előállítása Lombikban a D~ Streptomyees rimosus forma paromomycinus ATCC-21484 törzset tenyésztjük 2-3 napon át az alábbi összetételű, előzetesen pH 65 7,5-re beállított táptalajon: 7
