177890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 8- helyzetben szubsztituált adenin-származékok előállítására
3 177890 4 A találmány szerinti eljárást a továbbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. 1. példa 8-(2'-Karboxi-etiltio)-adenozin 380 mg (1,1 millimól) 8-bróm-adenozin 5 ml vízmentes hexametil-foszforsav-triamiddal készült oldatához szobahőmérsékleten keverve, száraz nitrogén atmoszférában 633 mg (4,2 millimól) 3-merkapto-propionsav-dinátrium-sót adunk (amelyet oly módon készítünk, hogy szobahőmérsékleten, vízmentes tetrahidro-furánban sztöchiometrikus mennyiségű nátrium-hidriddel kezeljük a merkapto-savat, majd csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert). 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük az elegy et, utána megszűrjük, 15 ml vizet adunk a szűrlethez, és a hexametil-foszforsav-triamid eltávolítása céljából többször kirázzuk kloroformmal. Hígított sósavoldattal 8,5-ös pH-értékre állítjuk az oldatot, formiát-fázisú DOWEX—1 ioncserélő gyantán kromatografáljuk, vizes hangyasavas gradiens elúcióval. Az UV-spektrumban 282 nm-nél maximumot mutató frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk, ily módon 327 mg 8-(2'-karboxi-etiltio)-adenozint nyerünk. A nyert termék tisztaságát a következő vizsgálatok igazolják : vékonyréteg-kromatográfia (fluoreszcencia-indikátort is tartalmazó szilikagél; futtató elegy: izopropanol—víz— —32%-os ammónia=7 : 2: 1; a foltok 254 nm-es hullámhosszú UV-lámpa alatt észlelhetők; Rf=0,56), valamint nagyfeszültségű elektroforézis (3MNÏ 11x57 cm-es Whatman-féle papír; elektrolit: 5,0-ös pH-jú 0,02 mólosammónium-acetát-oldat, feszültség: 5000 V, időtartam: 40 perc; a foltok 254-es hullámhosszú UV- lámpa alatt észlelhetők; a termék foltja — a karboxilcsoport jelenlétének megfelelően — az anód felé mozdul el, míg az adenozin a katód felé vándorol). A 0,1 mólos nátrium-hidroxidban mint oldószerben felvett UV-spektrumban 282 nm-nél van egy maximum, a 8-bróm-adenozin viszont 263 nm-nél mutat maximumot. Az NaOD-ben mint oldószerben felvett ’H NMR- spektrumban megtalálhatók az adenozinra jellemző sávok — kivéve a 8-as helyzetű proton jelét —, valamint az oldallánc protonjainak jelei: 2,88 (2 H, t, CH2COO) és 3,86 (2 H, t, CH2S). Tömegspektruma ugyancsak megerősíti a termék feltételezett szerkezetét (m/e: 239, 221, 192, 167). 2. példa Nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenozin-dinukleotid 118 mg (160 mikromól) nikotinsavamid-8-bróm-alanin-dinukleotid 2 ml vízmentes dimetil-szulfoxiddal készült oldatához szobahőmérsékleten keverve, száraz nitrogén atmoszférában 98,4 mg (656 mikromól) (az 1. példában leírt módon készített) 3-merkapto-propionsav-dinátrium-sót adunk. 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük az elegy et, utána megszűrjük, majd 10-szeres térfogatú acetont adunk a szűrlethez. Centrifugálással elkülönítjük, majd acetonnal kimossuk a kivált csapadékot, csökkentett nyomáson megszárítjuk, majd 15 ml 0,1 mólos sósavoldatban feloldjuk. Híg nátrium-karbonát-oldattal 7,5-re állítjuk be az oldat pH-ját, majd — vizes hangyasavas gradiens elúciót alkalmazva — formiát-fázisban levő DOWEX—1 ioncserélő gyantán kromatografáljuk. Az UV-spektrumban 276,5 nm-nél maximumot mutató frakciókat egyesítve fagyasztva szárítjuk, ily módon 90 mg nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinukleotidot nyerünk. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok (fluoreszcencia-indikátort is tartalmazó szilikagél, futtatóelegy: izovajsav—víz—32%-os ammónia=66: 33 : : 1,7; a foltok 254 nm-es hullámhosszú UV-lámpa alatt észlelhetők; Rf=0,31), és a nagyfeszültségű elektroforézis (3MM 11x57 cm-es Whatman-féle papír; elektrolit : 5,0 pH-jú 0,02 mólos ammónium-acetát-oldat, feszültség: 5000 V; időtartam: 30 perc; a foltok 254 nm hullámhosszú UV-lámpa alatt észlelhetők; a termék nagyobb mértékben mozdul el az anód felé, mint a NAD+, a karboxilcsoport jelenlétének megfelelően) álapján a termék tiszta. 8,7-es pH-jú pirofoszfát-pufferban mint oldószerben felvett UV-spektrumában 276,5 nm hullámhossznál jelentkezik egy maximum, amely az élesztőből kivont alkohol dehidrogenázzal végzett enzimes redukció után a 282 nm hullámhossz-értékre tolódik el, és 340 nm hullámhossz-értéknél megjelenik egy új, a redukált nikotinsavamid-vázra jellemző sáv. A DzO-ban mint oldószerben felvett *H NMR-spektrumban megtalálhatók a NAD+-ra jellemző sávok — kivéve a 8-as helyzetű proton jelét —, valamint az oldallánc protonjainak jeleit: 8 2,88 (2 H, t, CH2COO) és 3,86 (2 H, t, CH2S). Tömegspektruma ugyancsak megerősíti a termék feltételezett szerkezetét (m/e: 221, 192, 167). 3. példa Nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinuk-leotid-foszfát 50 mg (57,6 mikromól) nikotinsavamid-8-bróm-adenin-dinukleotid-foszfát 1 ml vízmentes dimetil-szulfoxiddal készült oldatához szobahőmérsékleten keverve, száraz nitrogén atmoszférában 36 mg (240 mikromól) (az 1. példában leírt módon készült) 3-merkapto-propionsav-dinátrium-sót adunk. 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd megszűrjük az elegyet, és utána 10-szeres térfogatú acetont adunk a szűrlethez. Centrifugálással elkülönítjük, acetonnal kimossuk, csökkentett nyomáson megszárítjuk, majd 10 ml 0,1 mólos sósavoldatban feloldjuk az ily módon nyert csapadékot. Hígított nátrium-karbonát-oldattal 7,5-re állítjuk az oldat pH-ját, majd klorid-fázisú DOWEX—1 ioncserélő gyantán, sósavval 3-as pH-értékre beállított vizes kalcium-klorid-oldattal gradíens-elúciót végezve, kromatografáljuk. A kívánt terméket tartalmazó kromatografált frakciókat egyesítjük, kis térfogatra betöményítjük, és vízzel eluálva, Sephadex G—10-en végzett gélszűrés-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
