177889. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B l2 vitamin aktivitású fermentlevek többirányú feldolgozására
7 177889 8 csőreaktorba vezetünk. A fermentlé áramlási sebességét úgy szabjuk meg, hogy literenként 42,0—44,0 ml, előnyösen 43,3 ml 10%-os vizes alumínium(III)-szulfát— —viz (Vig) oldat kerüljön hozzá. A reaktorból eltávozó csapadékos folyadék pH-értéke 5,0. A csapadékos levet laboratóriumi szeparátoron vezetjük át. Az edényben összegyűlő csapadékos sűrítményt ezután kisméretű poilasztva-szárító berendezésen megszárítjuk. 1,052 kg világosszürkés színű, finom port kapunk, melynek B]2 és faktor III. koenzim tartalma 1,832 g, mely 1,742 jxg/g koncentrációnak felel meg. Kitermelés: 96,7%. 4. példa 10 liter metanobaktériumos fermentlevet, amelynek a Bj2 és faktor III. koenzim tartalma 250,0 mg, pH-értéke pedig 6,6, 43,5 g alumínium(III)-szulfát—víz (V 18)-et és 2 ml tömény kénsavat tartalmazó 200 ml vizes oldatba öntjük. Egy perces intenzív keverés után a csapadékos fermentlevet, amelynek pH-ja 4,8, poharas centrifugán tömörítjük. A leülepedett csapadékot porlasztvaszárító segítségével megszárítjuk. A finom, por alakú termék súlya 110 g, amelynek B12 és faktor III. koenzim tartalma 2,227 [xg/g, összesen pedig 245,3 mg. Kitermelés: 98,0%. 5. példa 10 liter metanobaktériumos fermentlevet, amelynek B,2 és faktor III. koenzim tartalma 230 mg, pH-ja pedig 6,2, 43,5 g alumínium(III)-szulfát—víz (Visl-et tartalmazó 200 ml vizes oldatba öntjük. Rövid ideig tartó keverés után a csapadékos fermentlevet labor szeparátoron szétválasztjuk. A csapadékot porlasztva-szárítón megszárítjuk. A nyert por alakú termék súlya 102 g, amelynek B12 és faktor III. koenzim tartalma 2,147 [Xg/g, összesen pedig 218,96 mg. Kitermelés: 95,2%. 6. példa A 3. példa szerint előállított 1,0 kg száraz terméket, mely összesen 1,742 g B12 és faktor III koenzimet tartalmaz, 10 literes, keverővei és visszafolyató hűtővel ellátott zománcozott duplikátorba szórjuk, melybe előzőleg 5,0 liter 80 térfogat%-os metanolt öntünk. A zagyot állandó keverés mellett 1 óráig visszafolyató hűtő alkalmazásával forraljuk. A forró keveréket körülbelül 20 °C-ra lehűtjük és vákuummal leszűrjük. A maradék pogácsát, a fentiekhez hasonló módon 5 liter 80%-os metanollal újból kivonatoljuk. Az egyesített kivonathoz 25 ml 10%-os vizes nátrium-nitrit-oldatot öntünk, majd az alkoholos oldatot 40 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott 1,2 liter vizes sűrítményben a sűrítmény 60 súly%-ának megfelelő mennyiségű ammónium-szulfátot oldunk, és egyszer 30térfogat%-nyi, majd egyszer 15 térfogat%-nyi acetonnal összerázzuk. Az elvált és egyesített acetonos oldathoz *4 térfogat%-nyi kloroformot adunk. A szerves oldószertől 125 ml sötétvörös színű vizes fázis különül el, melyet leválasztunk, az aceton-kloroformos elegyet pedig 50 ml desztillált vízzel kivonatoljuk. Az egyesített vizes koncentrátumból a szerves oldószer-nyomokat ledesztilláljuk, majd jól szellőző fülkében 0,3 g nátrium-cianidot oldunk fel benne, és 1 órán át állni hagyjuk. A továbbiakban a vizes koncentrátumból a cianokobalaminokat ismert módon kinyerjük: 1: 6 térfogat arányú fenol-kloroform-oldattal a B12-vitamint szelektíven kioldjuk, majd a visszamaradó vizes anyalúgból további 1: 4 térfogat arányú fenol-kloroform eleggyel a faktor III-at extraháljuk. A B12-vitamin és a faktor III tartalmú extraktumokat — vizes fázisba történő átfordítás után — külön-külön bepároljuk, majd víz—aceton elegyből kristályosítjuk. Kitermelés: 1,458 g kristályos B12-Vitamin és 0,162 g faktor III, melynek minősége megfelel a XIX. amerikai gyógyszerkönyv előírásainak. Melléktermékként 961 g száraz port kapunk, melynek a XIX. amerikai gyógyszerkönyv szerint mért mikrobiológiai aktivitása 127 ixg/g hatóanyag, összesen pedig 0,122 g. Kiindulási anyagra vonatkoztatott kitermelés 100%. 7. példa A 2-es példában leírtakkal analóg módon előállított 100,0 g szárazterméket, amely összesen 217 mg B12 koenzimet tartalmaz, 1 literes csiszolatos gömblombikba szórjuk. A lombikra visszafolyató hűtőt és keverőt szerelünk. 500 ml 80 térfogat%-os metanolt öntünk hozzá, majd az egészet vízfürdőre helyezzük. A továbbiakban minden műveletet lesötétített, gyengén szórt fényben végzünk. A Visszafolyatást 1 órán át folytatjuk, majd a forró alkoholos kivonatot körülbelül 20 °C-ra hűtjük. Ezután szívópalackba helyezett, szűrőpapírral fedett porcelán Büchner-tölcséren a keveréket vákuummal leszívatjuk. A maradékot kevés 80 térfogat%-os metanollal átmossuk, és újabb 500 ml 80 térfogat %-os metanollal a kivonatolást megismételjük. Az egyesített alkoholos oldatokat 40 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten csökkentett nyomáson alkoholmentesre pároljuk. A körülbelül 150 ml sötétbarna színű vizes sűrítményt a 6. példában leírt ammónium-szulfátos, majd acetonos kezeléssel tisztítjuk, majd ismert módon a benzilalkoholos kivonatolást követő fenol-kloroformos tisztítás után, acetonnal 200 mg kristályos B12 koenzimet nyerünk. Kitermelés: 92,0%. 8. példa A 6. példában leírtakkal analóg módon járunk el, azzal a két különbséggel, hogy a metanolos kivonatolás utánnátrium-nitrit helyett ammónium-tiocianátot adunk az extraktumhoz, továbbá, hogy nátrium-cianid helyett ismételten ammónium-tiocianátot adunk a vizes koncentrátumhoz. Kitermelés: 1,210 g kristályos tiocianáto-kobalamin és 0,150 g kristályos tiocianáto-faktor III. Melléktermékként 950 g száraz port kapunk, melynek a XIX. amerikai gyógyszerkönyv szerint mért mikrobiológiai aktivitása 115 jxg/g hatóanyag, összesen pedig 0,109 g. A kiindulási anyagra vonatkoztatott kitermelés 84,33%. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
