177878. lajstromszámú szabadalom • Eljárás albumin kinyerésére vérplazmából
3 17787g 4 könnyen kivitelezhető módon teszi lehetővé az albuminnak nagy tisztaságban való elkülönítését és a vérplazmában levő egyéb fehérjefrakciók nagy részének natív formában való kinyerését. A találmány alapja az a felismerés, hogy ha a polietilénglikolos frakcionálási követően kapott, kis menynyiségű egyéb fehérjét is tartalmazó albumin-oldatot a polietilénglikol jelenlétében hőkezelésnek vetjük alá, akkor az albumin továbbra is oldatban marad, az összes többi fehérje pedig jól szűrhető formában kicsapódik. Fentiek alapján a találmány eljárás nagy tisztaságú albumin kinyerésére vérplazmából olyan módon, hogy az albumin melletti fehérjék nagy részét 10-—25 súly% mennyiségben adagolt, 2000—6000-es molekulasúlyú polietilénglikollal kicsapjuk, a kicsapott fehérjéket elkülönítjük az oldattól, és az oldathoz nátrium-kaprilát stabilizálószert adagolunk. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a polietilénglikollal kicsapott fehérjék eltávolítása után kapott, egyéb szennyező fehérjéket még mindig tartalmazó albuminoldatot 1—6 súly%-nyi polietilénglikol jelenlétében 60—70 °C-on, előnyösen 65—69%-on hőkezelésnek vetjük alá, majd a jól szűrhető formában kicsapott egyéb fehérjéket az albumin-oldattól elkülönítjük. Az eddigi ismeretek alapján a polietilénglikol jelenlétében végrehajtott hőkezelés alkalmazása nem volt kézenfekvő és az a tény, hogy egy lépésben tiszta albumint nyerünk a módszerrel, nem volt előre látható. A polietilénglikol ugyanis, noha régóta használják fehérjekicsapószerként, a fehérjét nem denaturálja, sőt egyes nézetek szerint kifejezett fehérje stabilizáló hatása van. A polietilénglikol, az alkohollal ellentétben, nem a fehérje ún. negyedleges szerkezetének felbontásával csapja ki a fehérjét, ami a nativitás elvesztését is jelenti, hanem a poláros gyökökből álló polietilénglikol láncmolekula egy gombolyagot alkot, és a belsejében igen nagy mennyiségű vizet köt meg. Ily módon kiszorítja a fehérjéket az oldatból, elfoglalja azt a teret, amit a fehérjék foglaltak el. A fentiek alapján nem volt várható, hogy a polietilénglikol jelenlétében végrehajtott hőkezelés szelektív denaturálódáshoz'vezet, vagyis, hogy elvégezhető a fehérjék részleges denaturációja, mégpedig oly módon, hogy közben az albumin és csak az albumin natív állapotban marad. Az eljárás során egy lépésben, tehát egy kicsapással és egy hőkezeléssel állítottunk elő olyan nagy tisztaságú albuminoldatot, amely minden további kezelés nélkül alkalmas a közvetlen felhasználásra. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa 100 ml friss emberi vérplazma pH-ját sósavval 6,5 ±0,1 értékre állítjuk be. Az oldathoz 12 s.% mennyiségű 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt adunk, és fél órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. A képződött csapadék újra feloldható, nem denaturálódott globuünokat tartalmaz, az oldatban pedig albumin és legfeljebb 30% egyéb fehérje található. A csapadékot 2000 g érték mellett, 20 percig végzett centrifögjUással vagy szűréssel elkülönítjük az oldattól. Az oldathoz, amely 5% polietilénglikolt tartalmaz, hozzáadunk 0,05 mól nátrium-kaprilátot, ezután 60 °C hőmérsékletre felmelegítjük az elegyet és 2 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartjuk. A hőkezelés hatására az albumin kivételével valamennyi egyéb fehérje jól szűrhető formában kicsapódik. A hőkezelést végezhetjük 68 °C hőmérsékleten is; ebben az esetben 20 perc elegendő a megfelelő szétválasztás eléréséhez. Az oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük, és a csapadékot szűréssel eltávolítjuk. A szűrletből az albumin mellől a polietilénglikolt ultraszűréssel (Millipore Pelicon Casette rendszer) eltávolíthatjuk, olyan membránt alkalmazva, amely a 10 000-nél kisebb molekulasúlyú komponenseket engedi át. Az ultraszűrés egyben az albumin-oldat koncentrálására is szolgál. Az eljárás során kapott albumin 98% tisztaságú, és kielégíti az Egészségügyi Világszervezet előírásait. 2. példa Egy liter ACD vagy CPD típusú vértartósító oldatba vett vérből kinyert plazmához adunk 150 g szilárd, 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt és az elegyet keverjük a polietilénglikol feloldódásáig, majd további 30 percig. Ezután centrifugán eltávolítjuk a keletkezett csapadékot és a felülúszó részhez további 70 g polietilénglikolt adunk, így a polietilénglikol koncentráció 22 súly%. Ekkor leválik egy második csapadék, amely főleg albuminból áll. Ezt az albumin csapadékot szintén centrifugálással elválasztjuk a felülúszó rétegtől. Ezután a csapadékot desztillált vízben feloldjuk. A feloldott csapadékhoz adunk 0,05 mól nátrium-kaprilátot (további polietilénglikol adagolására nincs szükség, mert a csapadék 2—3 súly% polietilénglikolt tartalmaz). Ezt az oldatot 1 órán keresztül 68 °C hőmérsékleten hőkezeljük, majd gyorsan lehűtjük. A kivált denaturálódott fehérjéket szűréssel eltávolítjuk, így egy nagyon tiszta albumin oldatot nyerünk. A kinyert albumin mennyiséget Kjeldahl-módszerrel elvégzett fehérje meghatározással mérhetjük. A mérés szerint a leírt módszerrel 1 liter plazmából 29,5 g albumin állítható elő. Az oldatban maradt polietilénglikolt ultraszűréssel eltávolítjuk és az oldatot sterilre szűrjük, majd megfelelő ampullákba töltjük. Az ampullákat 10 órán keresztül 60 °C hőmérsékleten hőkezeljük a hepatitis vírus eltávolítása érdekében. 3. példa Az albumin előállítására felhasznált plazmából először úgynevezett krioprecipitátumot állítunk elő az ismert módszerrel, amely abból áll, hogy a plazmát megfagyasztjuk, majd +4 °C hőmérsékleten felolvasztjuk és a visszamaradó, ezen a hőmérsékleten oldhatatlan csapadékot eltávolítjuk. Ezután más, ismert módszerrel DEAE—Sephadexet alkalmazva kinyerjük az úgynevezett protrombin-komplex koncentrátumot, és az így visszamaradt plazmát használjuk az albumin előállítására. Az albumint a 2. példában leírt módon 150 g polietilénglikol adagolásával állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a töményítést nem további kicsapással, hanem ultraszürfesel végesük. A poli-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
