177805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem kötörr hormonok vagy gyógyszerek meghatározására
3 177805 4 zett hormont tartalmazó oldattal eluáljuk, a jelzett hormont hagyjuk az immobilizált antitesttel reagálni, majd az antitesttel nem reagált jelzett hormont eluáljuk és meghatározzuk a mennyiségét. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a nem kötött hormonok vagy gyógyszerek abszolút mennyiségének közvetlen meghatározását, és az eljárás egyszerű, gyors és automatizálható. A találmány szerinti eljárás a következő elven alapszik. A szérumban vagy a plazmában a hormonok vagy gyógyszerek a transzportfehérjékkel a tömeghatás törvényének megfelelő termodinamikai egyensúlyban vannak: H+B^HB, ahol H a szabad hormon vagy gyógyszer, B a transzportfehérje és HB a hormon-kötőfehérje-komplex. Az antitestet tartalmazó gél erősen megduzzad, amikor érintkezésbe kerül a szérummal. Ez a duzzadás igen gyorsan megy végbe és a diífuzibilis szabad hormonoknak és hormon-kötőfehérje-komplexeknek a szétválásához vezet, mivel a duzzadási folyamat során a mátrix kis pórusmérete miatt a mátrixba csak a viszonylag kicsi molekulák képesek behatolni. A kisméretű szabad hormon a folyadékkal behatol a mátrix Vi belső térfogatába, míg a fehérjék és a fehérjéhez kötött hormonok a gél kis pórusmérete miatt a Va külső térfogatban maradnak. A duzzadás következtében a szabad és kötött hormonok rendkívül gyorsan és teljes mértékben szétválnak. Mivel a gél V; belső térfogatában, amely a gél teljes térfogatának körülbelül 80—90%-át teszi ki, találhatók az antitestek, az oda beáramló hormonok az antitestekkel a következő reakcióba lépnek: Ak+H^AkH, ahol Ak az antitest, H a hormon és AkH az antitest-hormon-komplex. A következő lépésben az elúciót annyi ideig végezzük, hogy csak a Va külső térfogat elúciója történjen meg. A Va térfogatban találhatók többek között a kötőfehérjék és a hormon-kötőfehérje-komplexek. A duzzadási folyamat után a diífuzibilis szabad hormon főleg a gél V} belső térfogatában található, és ott az antitesttel reakcióba lép. Mivel a gél V; belső térfogata lényegesen nagyobb, mint a Va külső térfogat, az elúció során, amely a Va külső térfogatra terjed ki, a gélből csak kevés diífuzibilis hormon mosódik ki. Mivel a hormon-kötőfehérje-komplex elúcióját olyan oldattal végezzük, amely jelzett hormont tartalmaz, azok az antitestek, amelyek nem kerültek komplexbe jelzetlen hormonnal, a jelzett hormonnal képeznek komplexet. Mivel a jelzetlen és jelzett hormonok reakciója az antitesttel egymást követően játszódik le, a jelzett hormonnal történő inkubációnál nem kell megvárnunk az egyensúly beállását. Az antitesthez kötött és nem kötött jelzett hormonok szétválasztását egy bizonyos idő után puffer-oldattal végzett elúcióval érjük el. A jelzett hormonok koncentrációját az eluátumban vagy a gélben ismert módon, radioimmunológiai módszerrel mérjük. A nem jelzett hormonok radioimmunológiai meghatározása is ismert [Clinical Chemistry, 19/2,■ 145 (1973)]; Adott esetben más meghatározási módszerek is alkalmazhatók, mint például a fluoroim- ■ munológiai vagy az enzimatikus jelzéssel végzett meghatározás. , A találmány szerinti eljárás alkalmas a szérumban vagy plazmában előforduló, részben-specifikus vagy nem-specifikus kötőfehérjékhez kötött hormonok és gyógyszerek meghatározására. Számításba jönnek a pajzsmirigy-hormonok, különösen a tiroxin és trijódtironin, a szteroid-hormonok, mint a kortizol, tesztoszteron, progeszteron, ösztron, ösztradiol és ösztriol, valamint a szívglikozidok, mint a digitoxin és digoxin. Meghatározhatók továbbá vitaminok, különösen a B12 vitamin és a folsav, valamint a fehérjékhez erősen kötődő gyógyszerek, mint a véralvadásgátlók, fájdalomcsillapítók, szalicilátok és triciklusos antidepresszívumok. Az antitestek immobilizálására különböző gélek, mint például agaróz, cellulóz, üvegrészecskék, poliamid, poliakrilamid és akrilamid kopolimerek alkalmasak. A legutóbbi különösen alkalmas. A mátrixba zárt antitest előnye, hogy a nagyobb molekulasúlyú, zavaró molekulák számára nem hozzáférhető, nem szükséges a pipettázás és centrifugálás és szobahőmérsékleten hosszabb ideig eltartható. Az akrilamid kopolimerjeiben a kopolimerizált vegyületekkel a polimer-mátrix mikrokörnyezete befolyásolható. A hatás lényegében hidrofób, hidrofil és elektrosztatikus effektusokon alapszik. A polimer-mátrixnak kopolimerizációval történő variálásával az antitest kötési fajlagossága jelentősen emelhető és a nem kívánt keresztreakciók kizárhatók. Különösen előnyösek az akrilamidnak a következő vegyületek egyikével vagy közülük többel alkotott kopolimerjeinek alkalmazása: akrilsav, metakrilsav, metakrilamid, előnyösen akrilsav és metakrilsav származékai vagy sói. A kopolimerben az akrilamid részaránya 1—99 mól-százalék, előnyösen 5—95 mól-százalék, és különösen 20—80 mól-százalék. Különösen alkalmasak azok az akrilamidbólésmetakrilsavból előállított kopolimerek, amelyekben a metakrilsav 20—60 mól-százalékban ban. Az akrilsavat és metakrilsavat vagy azok sóit tartalmazó kopolimerek alkalmazásával savas vagy lúgos oldatok esetén neutralizációs vagy puffer-hatás érhető el. Sóként előnyösen alkáli- vagy alkáli-földfém sókat alkalmazunk. Az antitestek immobilizálását előnyösen úgy végezzük, hogy az antitestet tartalmazó oldatot bekeverjük a monomer oldatba, gyökös polimerizációt végzünk, majd a keletkezett polimerizátumot szétaprítjuk, mossuk és szárítjuk. A polimer-mátrix pórusméretét a monomer koncentrációjának variálásával kívánság szerint befolyásolhatjuk. Körülbelül 20%-os monomer koncentráció esetén a pórus nagyság 7—10 Angstrom. A találmány szerinti eljárás automatizált kivitelezésére alkalmas berendezést mutat az ábra. Az immobilizált antitestet kis 5 oszlopokba helyezzük, amelyeket 4 adapter lapon rögzítünk. Ez alatt helyezzük el az adagoló és gyűjtő edényeket 6 egységbe foglalva. Az 5 oszlopokat folyadék továbbítására alkalmas 7 vezetékkel csatlakoztatjuk az 1 és 2 pumpákhoz. A berendezést 3 elektronikus vezérlő szerkezettel irányítjuk. . A meghatározandó mintát reakcióedénybe töltjük és az immobilizált antitesttel töltött oszlop alá helyezzük. A vezérlő szerkezetet a: következő programra állítjuk: . Egyik vagy másik pumpa egy ideig olyan irányban működik (hátrafelé-menet), hogy a mintát a száraz, antitestet tartalmazó géllel töltött oszlopra szívja. Ezután rövid szünetet tartunk, ami alatt megtörténik a gél duz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60. 65 2
