177804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hormonok és gyógyszerek teljes mennyiségének meghatározására
3 177804 4 enzimatikusan hidrolizáljuk, majd a hormont vagy gyógyszert antitesttel reagáltatjuk és ezután a hormon vagy gyógyszer mennyiségét radioimmunológiai módszerrel határozzuk meg, azzal jellemezve, hogy immobilizált antitestet alkalmazunk. Az antitestet előnyösen polimer-gélbe zárjuk. Polimer-gélként előnyösen akrilamid-polimer vagy akrilamid-kopolimer jön számításba. Az immobilizált antitestek találmány szerinti alkalmazásával az antitestek védetté válnak az enzimmel szemben. Az antitest olyan polimer-mátrixba van zárva, amelybe az enzim nagy mérete miatt nem tud behatolni. Ezzel az egyszerű és elegáns megoldással a találmány szerinti eljárás során az enzim denaturálásának lépése elhagyható. Az eljárás így lényegesen kevesebb munkát és időt igényel. Az eljárás univerzálisan alkalmazható különböző rendszerekre, mivel a specifikus enzim-denaturáció elmarad. Különösen jelentős a találmány szerinti eljárás az automatizálás lehetőségét tekintve. A találmány szerinti eljárás a legkülönbözőbb olyan hormonok és gyógyszerek meghatározására alkalmas, amelyek a szérumban vagy plazmában részben-specifikus vagy aspecifikus kötőfehérjékhez vannak kötve. Számításba jönnek a pajzsmirigy-hormonok, különösen a tiroxin és trijódtironin, a szteroid-hormonok, mint a kortizol, tesztoszteron, progeszteron, ösztron, ösztradiol, és ösztriol, valamint a szívglikozidok, mint a digitoxin és digoxin. Továbbá vitaminok is meghatározhatók, különösen a B12 vitamin és a fólsav, valamint olyan gyógyszerek, amelyek erősen kötődnek fehérjékhez, mint például a véralvadás gátlók, dikumarol, fájdalomcsillapítók, szalicilátok és triciklusos antidepresszívumok. A meghatározás kivitelezésénél a hormont vagy gyógyszert tartalmazó szérumot vagy plazmát olyan enzim-oldattal hozzuk össze, amely a kötőfehérjét hidrolitikusan hasítja. Az enzim kiválasztása a specifikus kötőfehérje szerint történik. Rendszerenként a következő enzimek jönnek előnyösen számításba: Aminopeptidáz, bromelin, karboxipeptidáz, kimotripszin, elasztáz, leucinaminopeptidáz, lipáz, pankreatin, papain, pepszin, pronáz, proteáz, proteináz, termolizin és tripszin. Olyan hormonok meghatározásánál, mint a tiroxin és kortizol különösen alkalmasak az olyan proteolitíkus enzimek, mint a proteináz, pronáz és pepszin. A próba reakcióját az enzim-oldattal termosztált körülmények között, 35 °C-on vagy szobahőmérsékleten végezzük. A fehérjék enzimatikus hidrolíziséhez szükséges idő az alkalmazott enzimtől függ, 15 perctől 4 óra hosszat tarthat, sok esetben 15—30 perc. A fehérjék hidrolízise után a próbát jelzett indikátorhapténnal összekeverjük és az immobilizált antitestre felvisszük. A felvitelt több csatornás, dugattyús pumpa segítségével végezzük. A pumpa visszafelé-menetben a reakcióelegyet az immobilizált antitestet tartalmazó oszlopra szívja. A jelzett, illetve a nem jelzett, meghatározandó anyag és az immobilizált antitest közötti reakcióhoz bizonyos időre van szükség. Ennek eltelte után az antitesthez kötött és szabad haptén elválasztását vízzel vagy puffer oldattal történő elucióval végezzük. A meghatározandó anyag koncentrációjának mércéje az eluátumban mérhető, illetve meghatározható az oszlopon megkötött radioaktivitás. A radioimmunológiai elv például D. S. Skelley et al. [Clinical Chemistry, 19,146 (1973)] munkájából ismert. Esetenként alternatív meghatározási módszerek is számításba jönnek, mint a fluorimmunológiai meghatározás vagy az enzimatikus jelölés segítségével végzett meghatározás. Az antigének szintézisét, azaz az antiszérumok előállítását előnyösen házinyulak immunizálásával végezzük. Az antitestek izolálása és immobilizálása ismert [lásd például D. S. Skelley et al.; Clinical Chemistry, 19, 146 (1973)]. Az antitestek immobilizálását előnyösen úgy végezzük, hogy az antitestet tartalmazó oldatot bekeverjük a monomer oldatba, gyökös polimerizációt végzünk, majd a polimerizátumot szétaprítjuk, mossuk és szárítjuk. Monomerként előnyösen akrilamidot alkalmazunk. A mátrix előnyös variációihoz jutunk, ha akrilamid és különböző funkciós csoportokkal rendelkező akrilszármazékok, előnyösen akrilsav, metakrilsav és metakrilamid, kopolimerizációjával állítjuk elő a mátrixot. Kopolimerek alkalmazásával különösen a mátrix hidrofobitása és töltése befolyásolható és ezáltal az antitestnek a meghatározandó hormonokkal és gyógyszerekkel való reakciója is befolyásolható. A polimer-mátrix pórus-nagyságát a monomer koncentrációjának variálásával befolyásolhatjuk. Körülbelül 20%-os monomer koncentráció esetén a pórus nagyság 7—10 Angstrom. Ioncserélő polimer-mátrix alkalmazása is előnyös. Az ioncserélővel elérhető puffer-hatás a meghatározandó próba pH értékének megváltoztatására használható. Előnyös rendszerhez jutunk, ha az akrilamid mellett 20—60% akrilsavat és/vagy metakrilsavat tartalmazó kopolimert állítunk elő körülbelül 20%-os monomer oldatból kiindulva és a savcsoportoknak legalább egy részét alkáli- vagy alkáli földfém-sóvá alakítva. A találmányt részletesebben a következő példák segítségével világítjuk meg. 1. példa Tiroxin meghatározása pronázzal történő enzimatikus hidrolízissel Az antigént tiroxin-etilészterből kiindulva szintetizáltuk és karbodiimid segítségével albuminhoz kapcsoltuk. Az antitestet házinyulak immunizálásával állítottuk elő. Az antitestet ezután polimer-gélbe zártuk. 2,9 mól/liter akrilamid-monomer koncentrációt alkalmaztunk. Egy tételhez 5 gramm akrilamidot és 1,25 gramm N,N'-metilén-bisz-akrílamidot főzőpohárban, 24 ml 7,2 pH- értékű foszfát-pufferban oldottunk fel. 1 ml foszfát-pufferban levő antiszérum hozzákeverése után a reakciót 0,15 mg riboflavinnal és 0,10 ml N,N,N',N'-tetrametil-etilén-diaminnal indítottuk be, és a reakcióelegyet ultraibolya fénnyel besugároztuk. A 45 perces besugárzási idő alatt a hőmérsékletet 50 °C alatt tartottuk. A keletkezett gélmasszát végül aprítottuk, desztillált vízzel mostuk és szárítottuk. A null-szérum előállítása oly módon történik, hogy 1 ml szérumot 2 mg/ml koncentrációjú pronáz-oldattal 30 percig reagáltattunk, majd az elegyhez 2 gramm ioncserélő gélt (Amberlite 400) adtunk. 50 ixl, 100 ml-enként 18 jxg tiroxint tartalmazó null-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
