177708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás intravénásan elviselhető gamma-globulinok előállítására
3 177708 4 Növekvő pH-értéknél a proteinben a kationok száma csökken, és a csere nem lesz teljes. Az albuminok, globulinok és prolaminok szintén kötődnek. Szérumglobulinokkal a reakció a szilikátkristály szélétől számítva csak 20—30 Â mélységig megy. Az albuminok a szilikátrétegek között helyezkednek el. A 14,5—15 Â rétegvastagságból következik, hogy a protein számára csak maximum 5,5—6 Â vastagságú réteg áll rendelkezésre. Mivel a teljes gamma-globulin mennyiségben sértetlen és sérült molekulák egyaránt vannak, arra törekedtünk, hogy a sérült molekulákat valamilyen módon megkössük, és így a fiziológiailag megfelelő molekuláktól kémiailag elválasszuk. A sérült molekulák hidrogénhídkötéseket képesek létesíteni, ezért erősen kötődnek a szilikát-rétegek közé, míg a sértetlen gamma-globulin molekulák visszamaradnak az oldatban. A réteges szilikátban kötött sérült gamma-globulin molekulák könnyen eltávolíthatók, például centrifugálással. A találmány szerint szükséges kationcserélő tulajdonságot Hoffmann szerint [Z. Kristallogr. (A) 98, 31 (1937); Chemie 55, 283 (1942)] a kaolin, és a vele rokon anyagok (például a halloizit, Al203 • 2 Siö2 • 4 H20), valamint bizonyos csillámszerű ásványok is mutatják, melyek rácsszerkezete rokon. A batavit (mely vasmentes vermikulit) szerkezeti képlete Weiss és Hoffmann (Z. Naturf., 6b, 405) szerint a következő: {(Mg2i64Alo,33X(OH)lj94]Si2j99Alljo101o}0’68++Mgí,3+4+ +2,34 H20. Azt találtuk, hogy ez az anyag, éppúgy, mint a montmorillonit, belsőkristályos duzzadóképességgel és magas kationcserélő tulajdonsággal bír. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a batavit maximum 5 súlyszázalék humán albumint vesz fel, miközben a fehérje a szilikát rétegek közé hatol. A vermikulit, melynek megközelítő szerkezeti képlete a következő: {(Mg3, Al2, Fe?, FeTM)(OH)2[Si3j35Al0j6JO10]}0’6í- + +0,65 Me+ is mutatja a kívánt rétegképződést és duzzadóképességet. A vermikulit tulajdonképpen trioktaéderes montmorillonit, azonban kristályai nagyobbak és rácsa szabályosabb. összefoglalva, a gamma-globulin tisztításához olyan ásványok felelnek meg, melyek réteges szerkezetűek, a szilikátrétegek között kationok vannak, és duzzadásra hajlamosak. A kísérleti tapasztalatok alapján az ilyen ásványok a hibás gamma-globulin molekulákat visszatartják — nyilván erős kation-aktivitásuk miatt — és a sértetlen molekulákat nem kötik meg. Ugyanakkor szükséges a koncentráció és a pH-érték bizonyos határait betartani. A találmány szerinti eljárás során különösen a montmorillonit, a batavit, vagy a vermikulit alkalmas. A gamma-globulin feloldott mennyiségének megfelelően az oldathoz célszerűen 0,2—5 súlyszázalék szilikátot adagolunk. A kísérleti tapasztalatok szerint a reakció 4 és 20 °C között megy végbe, 4,0—7,6 pH-érték között. A reakcióidő előnyösen 3 és 10 óra között van. A szilikát elválasztása előnyösen centrifugálással történik. Ugyanakkor azonban más ismert eljárások is alkalmazhatók, például az elárasztásos szűrés. A találmányt az alábbi példák részletesen ismertetik. 1. példa a) A gamma-globulin elválasztása: Összegyűjtött plazmából indulunk ki, melyet 8% etanol adagolásával 7,2 pH-értéken és — 3 °C-on kicsapunk. Ily módon leválik az I frakció. A felülúszóhoz —5 °C-on 5,8 pH-értéknél 19% etanolt adunk. Ekkor kiválik a II—III frakció, mely gamma-globulinokból áll. A csapadékot újra oldjuk, és 5 pH-értéken 8% etanollal ismét kicsapjuk. A maradékot 25% etanoFal 7,2 pH-értéknél újra kicsapjuk. Az így keletkezett csapadék (II. frakció) legalább 90% gamma-globulint tartalmaz. b) Az anti-komplementáló hatás csökkentése: A gamma-globulin csapadékot pufferolt vizes oldatban 7,0 pH-értéknél körülbelül 6% koncentrációban feloldjuk, miközben a vizes oldathoz 10% hidroxietil-keményítőt adunk. Az oldathoz ezután vizes Bentonit SF-szuszpenziót adunk (főkomponens: montmorillonit; szemcsenagyság kisebb mint 80 fz, gyártó: SERVA Feinbiochemika, Heidelberg). Az oldatot, mely összesen 2,5 súlyszázalék bentonitot tartalmaz, összekeverjük, majd 6 órán keresztül 15 ±2 °C-on állni hagyjuk. Ezután a bentonitot a nem kívánatos alkotórészekkel együtt 10% polietilén-glikol hozzáadása után centrifugálással eltávolítjuk. c) Fiziológiás konyhasó-oldatba való átvitel: A centrifugálás után a visszamaradó oldat tartalmazza a sértetlen gamma-globulint. Az oldatot 0,1 n nátriumhidroxid-oldattal 7,2 pH-értékre állítjuk, és 20 súlyszázalék polietilén-glikolt adunk hozzá, ily módon a tiszta gamma-globulin csapadék válik ki. A csapadékot centrifugálással kinyerjük, fiziológiás konyhasó-oldatban 5,2%-os fehérjekoncentrációra állítjuk be, végül sterilre szűrjük. A kapott termék terápiás célra alkalmas. Az eljárás kitermelése 92—99% (a sérületlen fehérjére számítva). 2. példa Az a) és c) lépések megegyeznek az 1. példáéval, a b) lépés az alábbiak szerint változik: A gamma-globulin csapadékot 7,4 pH-értéknél körülbelül 4 súlyszázalékos oldatba visszük, miközben a vizes oldathoz 8% hidroxietil-keményítőt adunk. Az oldathoz ezután 5 súlyszázalék finomra őrölt (részecskenagyság kisebb 80 ja-nál) vermikulitot adunk, szuszpenzió alakban. Az elegyet erősen összekeverjük, majd 8 órán keresztül 15 ± 2 °C-on állni hagyjuk. Ezután az oldathoz 10 súlyszázalék hidroxietil-keményítőt adunk, végül a vermikulitot a nem kívánatos gamma-globulin-résszel centrifugálással eltávolítjuk. Ezután következik a c) lépés. Az immun-elektroforézis diagramokon való mérésekből és számításokból kiderül, hogy a tiszta gammaglobulin kitermelés növekedik, ha a találmány szerinti eljárást alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárással nyert gamma-globulin nem alakult át, vagy változott kémiailag. Az így nyert gamma-globulin abszolút biztosan intravénásán elviselhető, és gyakorlatilag nincs anti-komplementáló tulajdonsága. Ezen felül nagyon stabil, ami tárolási kísérletekkel igazolható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
