177561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliamidhoz kötött, biológiailag aktív protein előállítására
5 177561 6 nek helyett azok szubsztrátuma is rögzíthető. így például radioaktívan jelzett zselatin rögzíthető a poliamidon. Ilyen poliamidon rögzített zselatin hidrolitikus enzimek kimutatására alkalmas, érzékeny reagensként használható. így például egy műanyagból készült kémcső poliamidhoz kötöttjelzett zselatin-bevonattal látható el, és a kémcső hidroláz-oldattal történő megtöltése után az oldatba átment jelzett anyag meghatározható. A találmány szerinti eljárás során a láncban —CO—N— általános képletű I CH I R lánctagokat tartalmazó poliamid-származékot a proteinreagenssel, illetve kapcsolóreagenssel és a biológiailag aktív proteinnel vagy proteinszubsztrátummal egy vagy több lépésben reagáltathatjuk. Egy lépésben végrehajtott reakciónál vizes oldatban végezzük a reakciót a biológiailag aktív proteinnel vagy proteinszubsztrátummal és a kapcsolószerrel. Ennek az eljárási változatnak előnye az egyszerűsége, de ily módon gyakran rosszabb kitermelés érhető el, mint a többlépéses eljárásnál, mert az említett poliamid-származék egy része saját magával kapcsolódhat, és nem kívánt mellékreakciók mehetnek végbe. A többlépéses módszernél először a kapcsolószerrel reagáltatjuk a láncban —CO—N— I CH I R általános képletű lánctagokat tartalmazó poliamid-származékot, majd az így kapott terméket a proteinnel vagy protein-szubsztrátummal. Továbbá, a protein-kapcsolószerrel a protein térhálósítható, a térhálós protein a nem térhálósított proteintól elválasztható. Ezután a térhálósított protein ugyanazzal, vagy egy másik protein-kapcsoló reagenssel reagáltatható az említett poliamid-származékkal. Az ilyen, térhálósított proteinszármazékok megkötése különösen nagy aktivitást biztosít. A találmány szerinti eljárás első lépése, vagyis a formaldehiddel és a formaldehiddel kondenzálható vegyülettel végzett reakció 0 C° és 100 C° közötti hőmérsékleten hajtható végre. Ha hangyasavas oldatban vagy aminek jelenlétében dolgozunk, akkor konkurrens reakcióként a Leuckart—Wallach-féle reakció mehet végbe. Ezért ebben az esetben előnyösen a fentiekben jelzett alacsony hőmérséklet-tartományban dolgozunk. Formaldehid alatt a formaldehid szokásos formáit, vagyis vizes formaldehid oldatot, paraformaldehidet, trioxánt és egyéb formaldehidpolimereket értünk, amelyek a jelzett reakciókörülmények között szabad formaldehidként viselkednek. Különösen előnyös a trioxán használata, mert ez szilárd és kémiailag jól definiált anyag lévén a legkönnyebben kezelhető kvantitatív módon. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi biológiailag aktív proteinek vagy szubsztrátumaik poliamíd-alapú hordozókon különösen kíméletes módon történő megkötését, illetve fixálását. A protein ezzel az eljárással a közbenső termékként képezett, említett poliamid-származékhoz ; közvetlenül vagy tetszőleges nagyságú közbenső vegyületeken keresztül közvetve is köthető. Nagyobb távolság tartása, vagyis hosszabb „spacer” használata például akkor érdekes, ha már előre térhálósított proteineket akarunk diegkötni, vagyis ölyah agrcgátumokat, amelyek a biológiailag aktív proteinek több molekulájából állanak. Térbeli okokból ilyenkor gyakran van szükség aránylag hosszú „spacer”-ekre. A találmány szerinti eljárással rögzített biológiailag aktív proteinek, illetve protein-szubsztrátumok lehetnek vízben oldhatók és vízben oldhatatlanok. Vízoldható poliamidokkal végzett kapcsolás útján például a proteinek féligáteresztő hártyákon történő kivérzése csökkenthető vagy megszüntethető, stabilitásuk növelhető és gyógyszerként való alkalmazásuk tehető lehetővé. Oldhatatlan hordozóanyagokra történő kötésnél a biológiailag aktív protein visszanyerhetősége jelent alkalmazási szempontból előnyt. Használhatók azonban antigének és antitestek specifikus abszorbeálószerek céljára és az enzimatikus analízisben is. Az alábbi kiviteli példák a találmány szerinti eljárás további szemléltetését célozzák. 1. példa 0,3 mól feniléndiamint és 0,1 mól trioxánt 50%-os hangyasavba töltünk, és a reakcióelegyet 3 órán át egy 3 m hosszú nylon—6 csőben áramoltatjuk szivattyúval. A csövet ezután vízzel kimossuk, beletöltjük glutáraldehid 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borát pufferral készült 10%-os oldatát, 15 percig állni hagyjuk, ismét kimossuk, majd megtöltjük 2 mg glukóz-oxidáz/ml koncentrációjú 0,1 mólos, 7.8 pH-jú foszfát pufferral készült oldatával, és éjszakán át 4 C°-on állni hagyjuk. 0,1 mólos, 7,0 pH-jú, 1 mól konyhasót tartalmazó foszfátpufferral végzett mosás után 1.8 U/m cső enzimatikus aktivitást mérünk. 2. példa 20 g 1 mm hosszúságú nylon-pelyhet 50%-os hangyasavban szuszpendálunk, és 0,3 mól feniléndiaminnal és 0,3 mól trioxánnal 3 órán át 50 C°-on reagáltatunk. Leszűrés után a módosított nylonpelyheket mossuk, és 1:1 arányú hígított sósavban szuszpendáíjuk, 0 C°-ra hűtjük, és keverés közben 0 C -on 2,5 mólos nátriumnitrit-oldatot adunk hozzá. 60 perc eltelte után jéggel hűtött vízzel mossuk, és a származék egy részéhez azonnal 10 mg/ml koncentrációjú, 7,0 pH-jú foszfát pufferral készült gulkózoxidáz oldatot adunk hozzá. A fixálást követően éjszakán át 1 mólos nátriumkloridoldattal 4 C°-on mosott nylon-pelyhek 17 U/g aktivitást mutatnak. A frissen diazotált származék egy további részletéhez 0,1% tenziíl tartalmú, 8 pH-jú nátriumkarbonát pufferral készült a-foetoprotein-antitest oldatot adunk, majd éjszakán át állni hagyjuk. Az antitest fajlagos megkötését a mellékelt rajz szerinti diagram ábrázolja. 3—5. példák A 2. kiviteli példában leírt módon járunk el, de feniléndiamin helyett anilint, illetve dianizidint, illetve diaminodifenilmetánt használunk. Az antitestek fajlagos megkötését ugyancsak a mellékelt rajz ábrázolja. 6. példa 0,03 mól feniléndiamint és 0,01 mól trioxánt 50%-os ecetsavban oldunk, 60 Cc-ra melegítünk, majd az oldatot szivattyúval 3 órán át egy 2 m hosszú nyloncsövön keresz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
