177369. lajstromszámú szabadalom • Ipari molekula-szelektív érzékelő és eljárás annak előállítására
3 177369 4 oldására igen nagy számú különféle módszer áll rendelkezésre [O. R. Zaborsky: Immobilized Enzymes. CRC Press. Cleveland, Ohio. (1974)] - csak többé-kevésbé reprodukálható. Az érzékelők legkedvezőtlenebb sajátsága a rövid 5 élettartam pl. néhány nap, egy-két hét, amely a reakció-réteg kedvezőtlen felépítésével és kiképzésével van kapcsolatban. A használat során jelentkező további hátrány, hogy az érzékelőket, illetve a kötött állapotú enzimet tartalmazó gél-rétegeket 10 aktivitásuk megőrzése céljából használaton kívül alacsony hőmérsékleten pl.: — 1 ... 2 °C kell tárolni. Az ismert elektródok sérülékenyek, mechanikai szilárdságuk kicsi és válaszidejük hosszú pl.: 15 2 ... 8 perc, amely körülmény laboratóriumi - de főként ipari alkalmazásukat korlátozz*1. A felsorolt hátrányok elegendőek voltak arra, hogy a., igényelt egyszerű és szelektív méréstechnikát biztosító érzékelők a gyakorlatban ne terjedjenek el. 2<J A találmány szerinti érzékelő k instrukciójának további előnye az ismert érzékelőktől eltérően, hogy kiküszöböli a vonatkozási elektródból eredő ezüstionok okozta enzimgátló hatást. A találmány célja olyan ipari moiekula-szelektív 25 érzékelő biztosítása, ■>—-'y egyszerűen, rövid idő alatt, különleges szakértelem nélkül és reprodukálhatván állítható elő, továbbá, amelynek a mechanikai szilárdsága nagy, az érzékelő élettartama az ismertekének többszöröse pl. 1 év, a válaszideje 39 rövid pl. 40 ... 60 másodperc. A találmány alapját az a felismerés képezi-, hogy a célkitűzéseknek megfelelő minőségű érzékelő úgy állítható elő, hogy reakció-rétegét fehérje alapú természetes hártyán pl. bélfalon, vagy mű- 35 anyag pl. polipropilén filmen vagy fehérjeszerű anyagból készült hálóban pl. selyemhálóban vagy műanyag hálóban pl. poliészter hálóban, mint hordozón vagy hordozóban, utóbbiakkal kémiai vagy fizikai kötésben levő, vagy hordozó nélküli enzim 40 katalizátort vagy katalizátorokat kovalens kötéssel tartalmazó ún. háló a hálóban szerkezetű membránból alakítjuk ki. A háló a hálóban szerkezetű membrán lényegében olyan térhálósított műanyag pl. poliakrilamid, polivinilklorid film, amelynek 45 inert térhálójában inert fehérje és/vagy enzim molekulákból álló aktív térháló helyezkedik el. A találmány szerinti érzékelő membránjának szilárdsága struktúrája, továbbá a hordozóként használt anyagoknak az enzimekkel kémiailag ro-50 kon sajátsága és mechanikai szilárdsága, valamint a hordozóhoz kémiai vagy fizikai erőkkel kötött állapota következtében kiváló. Ugyancsak kimagaslóan jó a membránban a leírt módon immobilizált enzimek kémiai ellenállóképessége és stabilitása, 55 így az érzékelő hosszú ideig funkcióképes, használaton kívül pedig - adott esetben szobahőmérsékleten is - hosszú ideig pl. 1 év tárolható anélkül, hogy aktivitása jelentősen megváltozna. Előnyösen változik meg a háló a hálóban szerkezetű 60 reakció-rétegben elhelyezkedő enzimek fizikai-kémiai sajátsága is, pl. a mobilis enzimekhez viszonyítva jelentősen megnő az a pH-tartomány, — amelyben katalizátor sajátságuk kifejtésére alkalmasak. 65 A találmány szerinti membrán további kedvező sajátsága, hogy szilárdsága és az immobilizált enzimek koncentrációja tetszés szerint változtatható. A hordozóként használt természetes alapú membránok (halfélék léghólyagja, emlősök, hüllők bőrrészlete, egyes állatfajok szaruhártyája, bélfala, stb.) víz, gáz és ionátjárhatósága a méréstechnikai feladatok szempontjából ideális. További hasznos sajátságuk, hogy a reagensként vagy reakciótermékként szereplő gázok vagy ionok átjárhatóságának biztosítása mellett a mérést esetleg zavaró nagy molekula: Ívű anyagokkal — ez lehet maga a szubsztráó egyéb a mintában levő anyag — szemben át ... . :',tő rétegként viselkednek. A találmány szerinti érzékelő kialakítható úgy is. hogy reakció-rétegének kiképzésére egy, két reakdó-réteggel rendelkező vagy több egymásra rétegezett egy vagy két reakció-réteggel rendelkező membránt használunk fel. Ebben az elrendezésben mindegyik membránfelület más és más sajátságú enzimet tartalmaz immobilizált állapotban. 0-glükozid szelektív érzékelő esetében a minta felé eső membrán felülete /3-glükozidázt, a jelzőelektród felé eső membrán glükozoxidázt tartalmaz. Az első membránon levő enzim, a |3-glükozidáz a meghatározandó komponens, a )3-glükozid (pl. amigdalin, szalicin) és a víz között hidrolízis reakciót hoz létre, amelynek egyik terméke glükóz. A második membránon levő enzim, a glükozoxidáz a keletkezett glükóz és az oxigén közötti reakciót katalizálja. Az oxigén a membránok mögött elhelyezkedő jelzőelektródon koncentrációjával arányos mérőjelet hoz létre. Az oxigén-koncentráció csökkenéssel arányos jel a meghatározandó komponens koncentrációjával jól definiált függvénykapcsolatban van. Ezzel a kiviteli elrendezéssel méréstechnikai egyszerűsítések és szelektivitás növelés érhető el, ugyanakkor olyan termékek meghatározására is lehetőség van, amelyek egylépcsős reakcióban nem hoznak létre elektroanalitikai módszerrel mérhető terméket vagy változást a mérhető anyag koncentrációjában vagy aktivitásában. A találmány szerinti érzékelő megvalósítható úgy is, hogy a reakció-réteget képező membrán vagy természetes struktúrája hártya, vagy háló szeparált felületrészletében(ein) vagy adott felületrészletében(én) statisztikusan homogén eloszlásban más és más enzim-fajta van megkötve és a felületrészlethez egy vagy több jelzőelektród tartozik. Ezzel az elrendezéssel méretnövelés nélkül többfunkciós moiekula-szelektív érzékelők állíthatók elő, miáltal ugyanabban a mintában egyidejűleg több komponens meghatározása valósítható meg, vagy a mérést zavaró anyagok koncentrációjának párhuzamos mérésével azok hatása automatikusan vagy kézi úton számításba vehető. A találmány szerinti moiekula-szelektív érzékelők más változatainál a reakció-réteg mechanikai hatásokkal szembeni fokozott védelme és szilárdságuk további növelése céljából a membránnal érintkezésben inert műanyag háló vagy szövedék van elhelyezve. Más változataiknál - az igen rövid válaszidő elérése érdekében — a membrán egyik oldalának felületi rétegében impregnálást követő 2
