176627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3aalfa-h-4alfa-(3'-propionsav)-7abéta-metilhexahidro-1,5-indandion előállítására szitoszterin mikrobiológiai átalakításával
5 176627 6 használunk. A befejeződés után a kívánt transzformált szteroidot ismert módszerrel nyerjük ki. Például a fermentlevet és sejteket magábafoglaló fermentációs (transzformációs) elegyet erős bázissal (lásd fent) vagy puffer-oldattal például telített nátrium-hidrogénkarbonát oldattal stb. 8-as pH-ra állítjuk, majd a vízzel nem elegyedő szerves szteroidokat oldó oldószerrel extraháljuk. Alkalmas oldószerek a metilénklorid (előnyösen), kloroform, széntetraklorid, etilénklorid, triklóretilén, éter, amilacetát, benzol stb. Az I képletű vegyületet jó termeléssel kapjuk, ha a hidrogénkarbonáttal kezelt reakcióelegy pH-ját koncentrált ásványi savval, például sósavval 2-re állítjuk be. A reakcióelegyet ezután a fent leírt módon extraháljuk és I képletű vegyületet tartalmazó extraktumot kapunk. Ciklohexán lassú hozzáadása hatására 107—110 °C-on olvadó kristályos I képletű vegyületet kapunk. Az I képletű vegyület hasznos szteroidok előállításához szükséges intermedierként használható fel. A 3 880 884 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt eljárás kiindulási anyagává alakítható, amely eljárás a hasznos 19-nor-szteroidok totál szintézise. A kiindulási anyaggá alakítást irodalomból ismert módszerekkel, például ecetsavanhidrides és nátrium■acetátos kezeléssel végezhetjük. L. J. A. C. S. 85: 2135—2137. A találmány további részleteit a következő nem-korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük (a százalékok súlyszázalékok, és az oldószer arányok térfogatarányok): 1. példa M. fortuitum NRRL—B—2129 mutáns előállítása M. fortuitum ATCC 6842-ből a) Nitrozo-guanidines mutagenezis M. fortuitum ATCC 6842 sejteket 28 °C-on a következő összetételű steril beoltott táptalajon növesztünk: táptalaj (Difco) 8 g/liter élesztő extraktum 1 g/liter nátrium-propionát 0,5 g/liter desztillált víz, tetszés szerint 1 liter A pH-t 1 n nátrium-hidroxiddal sterilizálás előtt 121 °C-on 20 percig 7-re állítjuk. A sejteket 5 x 10s/ml sűrűségig növesztjük, szemcsézés végett centrifugáljuk, majd egyenlő' térfogatú steril 0,1 M nátrium-citráttal pH=5,6-ra mossuk. A mosott sejteket ugyanannyi citrát puíferben újra szuszpendáljuk, titráláshoz mintát veszünk (sejt számlálás) és nitrozo-guanidint adunk hozzá, amíg a koncentráció 50 p.g/ml lesz. A sejí-szuszpenzíót 37 °C-on 30 percig víz-fürdőn inkubáljuk, majd titrálásához ismét mintát veszünk és a maradékot centrifugáljuk és azonos menynyiségű steril 0,1 M kálium-foszfáttal mossuk amíg a pH=7 nem lesz. Végül a sejteket steril szénforrás nélküli kis mennyiségű só-táptalajban újra szuszpendáljuk, a táptalaj összetétele a következő : ammónium-nitrát 1,000 g/liter dikálium-hidrogénfoszfát 0,250 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrát 0,250 g/liter nátrium-klorid 0,005 g/liter vasszulfát-heptahidrát 0,001 g/liter desztillált víz, tetszés szerint 1 liter A pH-t 1 n sósavval sterilizálás előtt 121 cC-on 20 percig 7-re állítjuk be. A sejteket ezután a mutánsok kiválasztására lemezekre helyezzük. b) M. fortuitum NRRL—B—8129 mutáns kiválasztása és izolálása A fent leírt módon mutagenizáit sejteket hígítjuk és a következő összetételű táptalajt tartalmazó lemezekre 10 terítjük szét (módosított Fraser és Jerrel, 1963. J. Bioi. Chem. 205 : 291—295): glicerin 10,00 g/liter dinátrium-hidrogénfoszfát 8,40 g/liter kálium-dihidrogénfoszfát 4,50 g/liter 15 ammónium-klorid 2,00 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrát 0,30 g/liter vastriklorid-hexahidrát 0,05 g/liter desztillált víz, tetszés szerint 1 liter 15 g/liter agart adunk hozzá és a táptalajt 121 °C-on 20 autoklávba helyezzük 30 percre, majd steril Petrilemezekre helyezzük. Az ezen a táptalajon történő növekedés kiküszöböli a mutagenezis folyamatban termelt legtöbb auxotrófot, például a vitaminokat igénylő tenyészeteket, és olyan 25 növekedési tényezőket, hogy például kémiailag definiált médiumon történjék a növekedés. 28 °C-on 7 napig végzett inkubáció után a kapott telepeket a mutánsok szelektálására alkalmas teszt-lemezekre helyezzük, majd visszatesszük a glicerin-alapú táptalajt tartalmazó kont- 30 roll-lemezekre. A teszt-lemezek előállítását illetően 1. Peterson, G. E., H. L. Lewis és J. R. Davis 1962. „koleszterin és más víz-oldhatatlan szén-forrás egyenletes diszperziójának előállítása agar táptalajon” J. Lipid Research 3: 275—276. A minimális só-táptalaj előállítá- 35 sát az la példában ismertettük. 15 g/liter agart, és 1,0 g/liternek megfelelő szénforrást például szitoszterint vagy adrosztendiont (AD) adunk hozzá és a kapott szuszpenziót 30 percig 121 °C-on autoklávban tartjuk. A steril forró elegyet ezután steril keverőbe helyezzük, 40 percekig keverjük, majd steril Petri-lemezekre öntjük. Az eljárás során fellépő habzás problémát jelent, azonban a habzás csökkenthető, ha az elegyet forrón keverjük, és ha a megolvadt agar lemezek felszínét lángoljuk. Ily módon a vízben oldhatatlan szénforrás homogén 45 diszperzióját kapjuk, és így igen homogén, de homályos agar lemezeket állítunk elő. A kontroli-lemezeken növesztett és nem AD-t mint egyedüli szénforrásként tartalmazó teszt-lemezeken növesztett telepeket úgy tisztítjuk, hogy tápagar lemezekre vonalakat húzunk 50 (szélesztés). Miután 28 °C-on tenyésztettük a telepeket, az egyes kiónokat steril fogpiszkálókkal vesszük ki a tápagar lemezekről és újra vizsgáljuk oly módon, hogy egyedüli szénforrásként AD-t tartalmazó kockás lemezeket oltunk be. A tisztított izolátumokat, melyek még 55 mindig az eredeti tenyészettől eltérő fenotípust mutatnak, rázó lombikban értékeljük ki. c) Rázó lombikos kiértékelés 60 500 ml-es zárólombikok a következő összetételű 100 ml biotranszforraációs táptalajt tartalmaznak: glicerin 10,00 g/liter dinátrium-hidrogénfoszfát 8,40 g/liter kálium-hidrogénfoszfát 4,50 g/liter 65 ammónium-klorid 2,00 g/liter 3
