176623. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalcitoninszerű új polipeptidek előállítására
5 176623 6 heptapeptid vagy az 1—8. oktapeptid szintén hasonló módon állítható elő. A nonapeptid-szekvenciát 2—4 aminosavból álló kisebb peptidegységnek az egyes aminosavakhoz történő kapcsolásával állíthatjuk elő a C-terminális aminosavtól számított aminosav-szekvencia sorrendjében. Egyes aminosavakat, például a glicint, leucint, valint, a-amino-szuberinsavat, treonint, metionint, szerint vagy aszparagint előnyösen az aktívészteres módszerrel kondenzálunk. Kisebb peptideket, például a 2—4 tripeptidet előnyösen a Geiger- vagy Wünsch-módszerrel kondenzáljuk. Az aziddal, aktív észterrel vagy savanhidriddel végrehajtott kondenzáció során a dekapeptid karboxil-végcsoportját nem szükséges védeni. A karboxilcsoportot például metanollal, benzilalkohollal vagy más alkohollal végzett észterezéssel is védhetjük. Az észtercsoportot, például metilésztercsoportot híg nátriumhidroxid-oldattal távolíthatjuk el vagy úgy, hogy hidraziddá alakítjuk, a benzilészter-csoportot pedig katalitikus hidrogénezéssel távolíthatjuk el. A közbenső termék aminocsoportját szokásos védőcsoportokkal, például benziloxikarbonil-, tritil-, terc-butoxikarbonil- vagy 2-p-difenil-izopropoxikarbonil-csoporttal védhetjük. Kívánt esetben a karboxilcsoport észterezéssel védhető. A szerinben és treoninban a hidroxilcsoport szükség esetén éterezéssel védhető és erre a célra terc-butanolt, benzilalkoholt vagy más alkoholt használhatunk. Az említett benziloxikarbonil-, p-nitrobenzilészter- és benzilészter-csoportokat szénre leválasztott palládium jelenlétében katalitikus hidrogénezéssel távolítjuk el. Az N-tritilcsoportot vizes ecetsavval és a terc-butoxikarbonil-csoportot trifluorecetsavval hasítjuk le. Az o-nitrofenilszulfenil-csoportot szerves oldószerben hidrogénkloridot, hidrogéncianidot vagy kénsavat használva hasíthatjuk le. A difenil-izopropoxikarbonil-csoportot 7:1:2 arányú ecetsav—hangyasav—víz eleggyel távolítjuk el. A metilészter-, etilészter- vagy p-nitrobenzilészter-csoportot hidrazinhidráttal hidraziddá alakítjuk. A metilészter-csoportot híg nátriumhidroxid-oldattal és a terc-butilészter-csoportot trifluorecetsavval hasíthatjuk le. A 7—10-től a 31. aminosavakból álló C-terminális peptidfragmenst, amelyet az előző N-terminális pepiiddel kondenzálunk, előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a C-terminális aminosavat (31. aminosavat) vagy a C-terminális fragmenst azaz a 30—31., 28—31., 25—31., 24—31. vagy 23—31. aminosavakból álló szekvenciát az egyes aminosavakkal vagy 2—4 aminosavból álló kisebb peptidekkel az aminosav-szekvencia sorrendjében kondenzálunk. Például a 10—31. aminosavakból álló C-terminális peptidfragmenst úgy állítjuk elő, hogy egy aminosavat és egy kevés aminosavból álló pepiidet, például a 28—29. vagy 26—27. dipeptidet, a 20—23. tripeptidet, 15—18. tetrapeptidet és 10—12. tripeptidet a C-terminálistól számított aminosav-szekvencia sorrendjében aktiv észteres módszerrel vagy Geiger-módszerrel kondenzáljuk. Mindegyik csoportot előnyösen a következő védőcsoportok egyikével védhetjük: a-aminocsoportot terc-butoxikarbonil-csoporttal, oldallánc karboxilcsoportját benzilészter-csoporttal, -aminocsoportot o-klórbenziloxikarbonil- vagy diizopropilmetoxikarbonil-csoporttal, a szerin, treonin és tirozin hidroxilcsoportját benzilcsoporttal és az arginin guanidin-csoportjának aminocsoportját és a hisztadin iminocsoportját tozilcsoporttal védjük. A 7—10-től a 31. aminosavat tartalmazó C-terminális fragmens védőcsoportjait, például a 10—31. szekvenciájú dokozapeptidamid védőcsoportjait ismert módon távolítjuk el. Például a tritilcsoportot vizes ecetsavval hasítjuk le. A difenil-izopropoxikarbonil-, benziloxikarbonil- és terc-butoxikarbonil-csoportokat jégecet— hangyasav—víz elegyével, hidrogénezéssel, illetve trifluorecetsavval távolíthatjuk el. így védett a-aminocsoportot, védett e-aminocsoportot, adott esetben karboxilcsoporton és/vagy hidroxilcsoporton védett oldalláncot tartalmazó hentriacontapeptidamidot kapunk. Ezeket a védőcsoportokat az ismertetett módszerekkel távolíthatjuk el, előnyösen savval, például hidrogénfluoriddal, és így az I általános képletű végterméket kapjuk. Abban az esetben, ha a találmány szerinti új polipeptid előállítását a Meryfield-féle szilárd fázisú peptidszintézissel végezzük, akkor a szerinben, treoninban és tirozinban levő hidroxilcsoportot például benzilcsoporttal védhetjük, a hisztidin iminocsoportját például l-benziloxikarbonilamino-2,2,2-trifluormetil-csoportíal, az arginin guanidin-csoportját nitrocsoporttal és a glutaminsav oldalláncát benzilészter-csoporttal védhetjük; Az a-aminocsoport védőcsoportja például terc-butiloxikarbonil-, o-klórbenziloxikarbonil- vagy o-brómbenziloxikarbonil-csoport lehet. A védett peptidet a hordozó gyantáról eltávolítjuk, és a védőcsoportot vízmentes hidrogénfluoriddal hasítjuk le. Az összes védőcsoport eltávolítását egyetlen lépésben, trifluorecetsavval végzett hidrolízissel akkor hajtjuk végre, ha az aminocsoport védelmére terc-butoxikarbonil-csoportot, az oldalláncbeli karbonilcsoport védelmére terc-butoxicsoportot, a szerin, a treonin és tirozin hidroxilcsoportjának védelmére terc-butilcsoportot és a hisztidin iminocsoportjának védelmére 2,2,2-trifluor-l-terc-butoxikarbonilaminoetil-csoportot használunk. A találmány szerinti I általános képletű új polipeptidet szabad bázis vagy só alakjában kaphatjuk. A szabad bázist sójából a szokásos módon szabadíthatjuk fel. A szabad bázist farmakológiailag elfogadható sóvá úgy alakíthatjuk, hogy a bázist szervetlen savval, például sósavval, hidrogénbromiddal, kénsavval vagy foszforsavval vagy szerves savval, például hangyasawal, ecetsavval, borostyánkősavval, almasavval, citromsavval, borkősavval, benzoesawal, benzolszulfonsavval vagy toluolszulfonsawal reagáltatjuk. Az I általános képletű új polipeptid szerves vagy szervetlen anyag addicionálásával komplexé alakítható. Az említett komplexet úgy állítjuk elő, hogy hosszú szénláncú polipeptidhez bizonyos szervetlen vagy szerves anyagot adunk. Ennek jelentősége az, hogy a még nem tisztázott szerkezetű vegyület gyógyszerként a beadás után hosszú ideig hat. Az említett komplexképző anyagok közül megemlíthetjük a fémek, például kalcium, magnézium vagy cink szervetlen vegyületeit, különösen az említett fémek foszfátjait, pirofoszfátjait vagy polifoszfátjait. A komplexképző szerves anyagok közé tartozik például a nem-antigén jellegű zselatin, a karboximetilcellulóz, a poliglutaminsav stb. A leírásban, illetve példákban használt rövidítések jelentése a következő : BOC terc-butoxikarbonilcsoport, AOC terc-amiloxikarbonilcsoport, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
