176623. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalcitoninszerű új polipeptidek előállítására
21 176623 22 3,9 g terméket feloldunk 10 ml dimetilformamidban és 50 ml metanolban, hozzáadunk 30 ml 80%-os hidrazinhidrátot és éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. A reakció befejeződése után vizet adunk hozzá, a csapadékot kiszűrjük, vízzel mossuk, 100 ml metanolt adunk hozzá és visszafolyatás közben forraljuk. Ezután a reakciókeveréket szobahőmérsékletre lehűtjük és a csapadékot kiszűrve 1,4 g terméket kapunk. Md = —8,6° (c=0,8, dimetilformamidban). Aminosav-összetétel: Asp 1,10 (1), Thr 1,00 (1), Ser 1,64 (2), Leu 1,00 (1), a-amino-szuberinsav 1,08 (1). 31. BOC-Leu-Gly-OBzl 34 g N-etil-N'-metilaminopropil-karbodiimid 50 ml diklórmetánnal készült oldatát —5°-on 1 óra alatt keverés közben hozzácsepegtetjük 46,2 g BOC-Leu-OH, 1 g 1-hidroxibenzotriazolt és 74 g H-Gly-Obzl.TosOH 100 ml dimetilformamiddal és 200 ml diklórmetánnal készült oldatához, majd 1 óra múlva az oldatot szobahőmérsékleten éjszakán át keverjük. Ezután a reakciókeveréket vákuumban bepárolva a diklórmetánt eltávolítjuk. A dimetilformamidos réteghez vizet adunk és 1 liter, majd 500 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget n sósavval, vízzel, 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mossuk és vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepárolva 82 g olajos BOC-Leu-Gly-OBzl-t kapunk. Rf-értéke: 0,68. 32. BOC-Val-Leu-Gly-OBzl 70 ml trifluorecetsavat —5°-on hozzáadunk 76 g BOC-Leu-Gly-OBzl-hez, majd 30 percig keverjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot vákuumban nátriumhidroxidon szárítjuk, és ezután 200 ml dimetilformamidot adunk hozzá és az oldat pH-értékét — 5°-on körülbelül 50 ml trietilamin hozzáadásával 6,5-re állítjuk. A reakciókeverékhez 19 g BOC-Val-OSU-t és 2 g 1-hidroxibenzotriazolt adunk és N-metilmorfolinnal pH-értékét 6-ra állítjuk és 4 napig szobahőmérsékleten keverjük. A keverés közben a reakciókeverék pH-értékét N-metilmorfolinnal 6-on tartjuk. Ezután nagy mennyiségű vizet adunk hozzá, etilacetáttal extraháljuk és a kivonathoz 1 ml N,N-dimetilamino-l,3-propándiamint adunk és 30 percig keverjük. A kivonatot vízzel, n sósavval, 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mossuk és vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk. Az etilacetátot elpárologtatjuk és a terméket n-hexánból kristályosítva 90 g (94%) BOC-Val-Leu-Gly-OBzl-t kapunk. Olvadáspontja 119—121°. p---------------------(CH2)5-----------------------j 33. -CO-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCH-CO-Val-Leu-Gly-OH I-------------------(CH2)5---------g (1,42 mmól) -CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)--Thr(Bzl)-HNCHCO-NHNH2-t 5 ml dimetilformamidba szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz —5°-on 4 n sósavat tartalmazó 2 ml dioxánt adunk, és az anyagot 10°-on teljesen feloldjuk. Az oldathoz —5-----10°-on 0,3 ml izoamilnitritet adunk és 20 percig keverjük. A reakció befejeződése után — 50°-on 1,2 g H-Val-Leu-Gly-OH-t adunk az oldathoz és trietilamin hozzáadásával pH-értékét 7-re állítjuk és 2 napig jeges fürdőben keverjük. Ezután a reakciókeveréket hűtés közben lassan hozzáadjuk 200 ml 0,5 n sósavhoz. A csapadékot 0,5 n sósavval és vízzel mossuk, majd szárítva 1,5 g terméket kapunk. Kitermelés 84,3%. Olvadáspontja bomlás közben 240°. [a]o = —18,4° (c=0,7, dimetilformamidban). 2. példa :------------------------<ch2)5— í !-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly--Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr--Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Thr-Pro-N H2 500 mg (0,130 mmól) BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asn-Thr(Bzl)-Gly-Ser(Bzl)-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2-t feloldunk — 5°-on 5 ml trifluorecetsavban és 0,5 ml 4 n sósav és dioxán elegyben. Ezután 40 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk és etiléter hozzáadására csapadék válik ki. Ezt a csapadékot nátriumhidroxidon szárítjuk, majd 3 ml dimetilformamidban feloldjuk és 2,3 ml oldatot (100 p,mól) 1 ml-re bepárolunk, és pH-értékét hűtés közben trietilaminnal 7-re állítjuk. Az oldathoz 23 mg N-hidroxiszukcinilimidet, 90 mg (90 mmól) j--------------(CH2)5---------------r-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH-t és 41 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk, és 2 napig szobahőmérsékleten keverjük. A reakció befejeződése után a terméket 150 ml 1 mólos ecetsavval leválasztjuk, és a csapadékot kiszűrjük, vízzel alaposan mossuk, majd vákuumban szárítva 520 mg terméket kapunk. Az 520 mg por alakú terméket 50 ml hidrogénfluoriddal és 2 ml 1: 1 arányú fenol-anizol eleggyel 0°-on 90 percig reagáltatjuk. A hidrogénfluorid ledesztillálása után a maradékot 1 mólos ecetsavban feloldjuk, és az oldatot Dowex 1x2 (acetát-ciklus) ioncserélő műgyantával töltött oszlopon átbocsátjuk és az eluátumot fagyasztva szárítva 341 mg por alakú terméket kapunk. Ezt a terméket 0,01 mólos vizes ammóniumacetát-oldatban feloldjuk, és karboximetil-cellulózzal töltött 2,3 x 50 cm méretű oszlopra felöntjük, majd 700 ml 4,7 pH- értékű 0,01 mólos vizes ammóniumacetát-oldattal mossuk és 0,01—0,1 mólos ammóniumacetát-oldattal (4,5 pH) lineáris gradiens elúciónak vetjük alá. 10— 10 ml-es frakciókat gyűjtünk és a 80—111. frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítva por alakú terméket kapunk. Ezt 0,1 mólos ecetsavban feloldjuk, és Sephadex G—50 műgyantával töltött 2,2 x 105 cm-es oszlopon kromatografáljuk. Az elúciót 0,1 mólos ecetsavval 10 ml/óra sebességgel végezzük. 5—5 g-os frakciókat gyűjtünk, az 55—63. frakciókat összegyűjtjük, és liofilizálva 22 mg por alakú terméket kapunk. Ezt a port 0,01 mólos vizes ammóniumacetátban feloldjuk és karboximetil-cellulózzal töltött 2,3x25 cm-es oszlopra visszük, majd 600 ml 0,01 móltól 600 ml 0,1 mólig terjedő ammó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
