176482. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek rögzítésére hordozóanyagokon
9 176482 10 10. példa 30 g nylon-6-ot 100 ml hangyasavban oldottunk. Ehhez az oldathoz 10 g 0,315—0,400 mm szemcseméretű (égetett) agyagot adtunk. A részecskék pórusai ily módon megteltek a nylon-oldattal, de a részecskék még különállóak voltak (nem tapadtak össze). A hangyasav vákuummal végzett leszívatása után nátriumhidrogénkarbonát oldattal, majd desztillált vízzel semlegesre mostuk, a megszárított terméket a 9. kiviteli példában leírt módon PG5-oldattal és hexametiléndiamin-oldattal reagáltattuk, gyorsan 0,5 n NaOH-oldattal, majd semlegesre mostuk, végül akrilsav-hidroxiszukcinimidészter és akrilamid kopolimerének 5%-os oldatával 7,8 pH-n 4 órán át reagáltattuk. Ezt követően desztillált vízzel mostuk, és az agyagrészecskék 1 g-jához 2 ml olyan oldatot adtunk, amely 5 mg glukózoxidázt tartalmazott 1 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferre számítva. Éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk, leszívattuk, és NaClra 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpufferral mostuk. A részecskék 14 U/g aktivitást, térfogatra számítva 15 U/ml aktivitást mutattak. 11. példa 18,6 g CaCl2, 16,8 g víz, 63 g metanol és 1—1000 rész hangyasav elegyében 30—80 C° hőmérsékleten poliamidot oldottunk, és azt még melegen 2 m hosszú nylon-6 csövekbe töltöttük, majd ezután azokat hideg vízzel azonnal át öblítettük. A csövek belső falán amorf, reakcióképes nylon-réteg maradt vissza. A csöveket metanollal vízmentesre öblítettük, és PC15 5%-os kloroformos oldatával 4 C°-on éjszakán át állni hagytuk. Ezután hexametiléndiamin 20%-os metanolos oldatát töltöttük beléjük, és 1 órás állás után 5 liter desztillált vízzel mostuk ki őket. Ezt követően glutárdialdehid 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os oldatát töltöttük beléjük, majd 15 perc múlva 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral mostuk őket. Időközben 372 mg glukózoxidázt 4,5 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferban oldottunk, és 6,4 mg etilénglikol-bisz-propionsav-bisz-hidroxiszukcinimidészter 0,5 ml dioxánnal készült oldatát adtuk hozzá, majd éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk az elegyet. Ezt a glukózoxidáz-oldatot 1 :4 arányban hígítottuk, és a térhálósított glukózoxidáz-terméket a csövekbe töltöttük. A csövek NaCI-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral végzett mosása után 50 cm-es csodarabokon 7 ml/perc áramlási sebességgel vizsgáltuk az aktivitást. Ilyen vizsgálati körülmények között három egymás utáni kísérletben 5, 7,5 és 9 U/m aktivitást mértünk. 12. példa Egy TYGON-csövet, amely módosi vinilpolimer, rövid ideig ciklohexanonnal oldottunk. Ezután a 11. kiviteli példában leírt módon készített nylon-oldatot töltöttünk belé, és a továbbiakban all. kiviteli példában leírt módon jártunk el. A vizsgálat során 3 U/m aktivitást mutattunk ki. 13. példa Egy nylon-csövet a 11. kiviteli példában leírtakhoz hasonlóan nylon-oldattal, majd PCl5-oldattal és hexametiléndiamin oldattal kezeltünk. A 11. példában leírttal analóg módon, 5 liter desztillált vízzel végzett mosás után metakrilsav-hidroxiszukcinimidészter és metakrilamid kopolimer 5%-os oldatát töltöttünk bele 7,8 pH-n. 4 óra múlva desztillált vízzel kimostuk, és 2 mg glukózoxidáz/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült oldatát töltöttük bele, majd éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk. NaCl-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral végzett mosás után a cső 50 cm-es darabjain 7 ml/perc átfolyási sebességgel végzett vizsgálatnál 2,4 U/m aktivitást mértünk. 14. példa 100 g nylon-6 granulátumot 300 ml tetrahidrofuránban (vízmentes) szuszpendálunk és a szuszpenziót háromnyakú lombikban szobahőmérsékleten 10 ml tionilklorid 89 ml tetrahidrofuránnal és 1 ml dimetilformamiddal készített oldatának lassú hozzáadása közben 1 órán keresztül keverjük. Ezután a folyékony fázist leszívatjuk, majd körülbelül 500 ml tetrahidrofuránnal (vízmentes) utánmossuk. Ezt követően 41 ml trietiléntetramin 59 ml tetrahidrofuránnal készített oldatával szobahőmérsékleten tovább reagáltatjuk. Körülbelül 2 óra múlva leszívatjuk, a szilárd maradékot 2 n nátriumhidroxid-oldattal, majd ioncserélőn tisztított vízzel mossuk. Az aktivált granulátum 10 g-nyi mennyiségén a 4. példa szerint 300 mg GOD-t kötünk meg. A nem-kötött aktivitás kimosása után az anyag fajlagos aktivitása 50—80 U/g nedves anyag. 15. példa Ragasztóanyaggal, majd nylon-pehellyel bevont szálakat az 1. példában ismertetettek szerint foszforpentakloriddal aktiválunk. „Spacerként” etiléndiamint és bifunkcionális protein-reagensként glutárdialdehidet alkalmazunk. 2 mg GOD 1 ml foszfát-pufferral, pH = 7,8 készített oldatát rögzítjük, majd öblítjük. A pehellyel bevont szál aktivitása ezután 0,73 U. Ha ugyanezt az eljárást, „spacer” nélkül végezzük és az aktív poliiminklorid-származékot közvetlenül alkalmazzuk a GOD rögzítésére, úgy a mosás után a bevont szál aktivitása 0,35 U/cm. 16. példa A 14. példa szerint aktivált nylon-hordozó (granulátum) 5 g mennyiségén 1% Anti-T4-antitestet tartalmazó, 3 ml 0,1 mólos, pH=6,8 foszfát-pufferben oldott, 60 mg mennyiségű immunglobulint kötünk meg glutárdialdehiddel, 0,05 ml glutárdialdehid (25%-os) hozzáadásával. 15 órán keresztül keverjük 4 °C-on. Ezután leszűrjük és 0,1 mólos, pH-6,8, 1 mólos nátriumkloridot tartalmazó 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
