176462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergolin-származékok előállítására fermentációs úton
1 176462 A képződött kolónia alakja: A középső része domború, kráter alakú bemélyedésekkel, a széle radiálisán hajtogatott, a teljes agar tele van a tenyészettel, a kolónia elemelkedik a lap aljától. A kolónia átmérője: 2—3 cm. A kolónia színe: A felső- és az alsórésze világos szürke. Átlagos spórásodás: 34,1 x 106 konídium/kolónia. 3. Táptalaj (2% glükóz, 50% vizes burgonya-extraktum, 3% agar, pH = 6,0) A képződött kolónia alakja: A középső része domború, kráter alakú bemélyedésekkel, a teljes agar tele van a tenyészettel, a kolónia elemelkedik a lap aljától. A kolónia átmérője: 1,5—2,0 cm. A kolónia színe: A felső oldala szürkés ibolya, az alsórésze szürkés barna. Átlagos spórásodás: 3,3 x 106 konídium/kolónia. A konídiumok és hifák mikroszkopikus jellemzői: A konídiumok minden esetben elliptikus alakúak, amelyeknek a hosszú tengelye 6-10 fim és a rövid tengelye 4—8£im. A szubsztrátum-hifák hoszsza legfeljebb 200 fim, az átmérőjük pedig 4-8 fim. A hólyagos domború résznek az átmérője 8-16 /am. Levegő-hifák is fellépnek, amelyeknek hossza több mint 200 fim, átmérőjük pedig 2-4 fim. A találmány szerinti eljárást az alábbi példák illusztrálják, minden korlátozó jelleg nélkül: 1. példa A konídium-spórák tenyésztéséhez sovány tejben liofilizálással szárított spórákat tartalmazó törzs-konzervből szuszpenziót készítünk, amelyet egy 3%-os agar táptalajon (pH = 6,0) 15% sörcefrével, 0,5% élesztő-extraktummal, 0,5% ammóniumfoszfáttal és 0,1% ammóniumcitráttal 14 napig tenyésztünk 19°C-on, ferde tenyésztésként. A szubmerz-tenyésztéshez oltóanyagként evvel az eljárással 1000 ml-es jénai szélesnyakú lombikokban 1 x 1010 spóra/tenyészedény mennyiséget kapunk. Az oltóanyaggal szükség esetén még 120 liter tápoldatot is beolthatunk. 2. példa Az inokulum előállítása céljából az 1. példa szerint kapott spóra-szuszpenziót átvisszük egy olyan folyadék-közegbe, amely 15% sörcefrét és 2% élesztő-extraktumot tartalmaz, olyan mennyiségben, hogy a spóra koncentrációja 1 x 105/ml legyen. A tenyésztést 500 ml-es gömblombikban 120 ml folyadék-közeggel 22 °C hőmérsékleten egy cirkulációs rázógépben végezzük. A tenyészet 14 nap után 6xl09 spóra/lombik mennyiséget tartalmaz, és ezt a tenyészetet alkalmazhatjuk oltóanyagként az alkaloida-fermentációhoz. 3. példa A spóra-tenyésztéshez szükséges inokulum előállítását az 1. példa szerint végezzük. Táptalajként 3%-os agar táptalajt (pH = 6,8—6,9) alkalmazunk, amely 3% szacharózt, 0,3% nátriumnitrátot, 0,1% káliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát-hepahidrátot, 0,05% káliumkloridot, 0,001% vas(II)-szulfát-hepahidrátot és 1% kukoricát duzzasztó vizet tartalmaz. 500 ml-es szűknyakú ipari üveg-lombikokban, ferde tenyésztéssel, 14 napig 24 °C-on végzett tenyésztéssel 3 x 109 spóra/edényt kapunk. Ez az anyag a kiindulási anyaga a szubmerz-tenyésztésnek, az alkaloid-szintézishez. 4. példa Az 1. példa szerint tenyésztett oltóanyag-tenyészet spóráit szuszpendáljuk, ennek egyrészét inokulumként azonos mennyiségekben elosztunk álló gömblombikokban (500 ml befogadóképességű), amelyek egyenként 120 ml elő tenyészet-táptalajt (10% szacharóz, 1,5% ammóniumcitrát, 0,1% kalciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, desztillált víz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson) tartalmaznak. A lombikokat 24 °C hőmérsékleten cirkulációs rázógépen rázzuk (175 U/perc). 7 nap múlva a lombik tartalmát átoltjuk 1 :10 arányban Erlenmeyer-lombikokba (500 ml befogadóképességű), amelyekbe egyenként 120 ml főtenyészét-táptalajt (20% szacharóz, 1% ammóniumcitrát, 0,1% kalciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, desztillált víz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson) helyeztünk. Ezeket a lombikokat ugyanolyan körülmények között rázzuk, mint ahogy az előbbiekben ismertettük. 14 nap múlva az Urk-reakció segítségével 2470 mg alkaloida/tenyészfolyadék-liter mennyiséget mutatunk ki, ergotoxin-dimaleinátként számolva. Az alkaloidákat Hohmann és Rochelmeyer [Arch. Pharmazie 297, 186—187 (1964)] módszerével analóg módon metilénkloriddal extraháljuk, majd formamiddal impregnált kovasavgélen vékonyréteg kromatográfiásan szétválasztjuk és ultraibolya spektrofotometrikus úton meghatározzuk. 1280 mg ergotoxint és 340 mg ergometrint kapunk literenként, a többi rész két eddig ismeretlen természetes peptid-alkaloidát, valamint egyszerű ergolin-származékokat, például agroklavint, kanoklavint tartalmaz. A leszívatás útján elválasztott micélium és szűrlet párhuzamos vizsgálata szerint a teljes ergometrin mennyisége, valamint a képződött ergotoxin 90%-a a szűrletben található. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
