176249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kardenolid-származékok mikrobiológiai átalakításánál a fermentlé szubsztrátum- koncentrációjának növelésére
3 176249 4 séhez szükséges oldószer mennyiség viszont már gátolja az átalakítást. Ugyancsak nem mutatható ki egyértelmű Összefüggés apoláris aprotikus illetve dipoláris aprotikus oldószerek és az átalakításnál alkalmazható szubsztrátum koncentrációja közt. Meglepő módon azt találtuk viszont, hogy az erős elektron donor sajátsága oldószerek alkalmazásával, azok protikus, aprotikus illetőleg | apoláris vagy dipoláris karakterétől függetlenül, az adott térfogatú vizes rendszerben korábbi eljárásoknál alkalmazott oldószeres adagolásokhoz képest többszörös mennyiségű, 50/ag/nl helyett 700—1000 jug/ml glükozid alakítható át. Fentiek alapján a találmány eljárás fermentlé szubsztrátum-koncentrációjának növelésére az I általános képletű - ahol X jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport, R jelentése pedig II, III, IV vagy V képletű csoport — kardenolidok mikrobiológiai átalakításánál az átalakítandó vegyületek szerves oldószerben történő adagolása útján, amely abban áll, hogy az I általános képletű kiindulási vegyületet elektron donor sajátságú, vízzel elegyedő és az adott vegyületet 5—20%-ban oldó oldószerben vagy ilyen oldószerek elegyében feloldva juttatjuk a fermentlébe. Vizsgálataink szerint előnyösen alkalmazható oldószerek a tetrahidrofurán, dioxán, tetrahidtofurfuril-alkohol, dimetilformamid, dimetilszulfoxid, dietilformamid, dietilacetamid, piridin, pirrolidin, n-metilmorfolin, hexametil-foszforsavtriamid vagy ezeknek az oldószereknek elegyei. A találmány fő előnye, hogy lehetővé teszi a szívglükozidok mikrobiológiai átalakításakor az adott fermentációs térfogatban a fermentációs idő kismérvű befolyásolása mellett a szubsztrátum mennyiségének nagymértékű növelését. További előnyt jelent, hogy a fenti donor sajátságú oldószerek közül lehetőség nyílik hővel sterilezhető oldószer kiválasztására. Ez az aszeptikus körülmények között kivitelezhető mikrobiológiai átalakításoknál az egyébként hőstabil szubsztrátumok steril adagolását nagymértékben megkönnyíti és biztonságossá teszi. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. 1. példa Streptomyces praecox MNG 127 jelű törzs 5-6 hetes, burgonyás dextrózos ferdeagaron nőtt tenyészetéről 10 ml steril vízzel szuszpenziót készítünk. A szuszpenzió 1—1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100-100 ml PS jelű táptalajt oltunk. PS táptalaj összetétele: 0,8% porszója 3,0% glükóz pH = 7,0 (sterilezés előtt), Sterilezés 45 percig 120°-on. A glükózt a táptalajhoz 50%-os oldatban külön sterilezzük 30 percig 120s-on. Porszója készítés: 0,4 mm fonaltávolságű szitán átszitált, extrahált szójadarából csapvízzel készült 10%-os szuszpenziót egy órán át 1 atm túlnyomáson hővel, majd 37°-ra lehűtve 0,4% pankreatinnal 2 órán át keverés közben hidrolizálunk, a pH-t nátriumhidroxid adagolással 7,5 és 8,0 közötti értéken tartva. Ezután a szuszpenziót centrifugáljuk, és a felülúszót porlasztva szárítjuk. Az így készült termék a porszója, 9% nitrogén-tartalommal. A beoltott lombikokat 32°-on rázatjuk két napig, majd a tenyészetekhez 70—70 mg digitoxint adagolunk 1. lombikhoz 1 ml tetrahidrofuránban oldva 2. lombikhoz 1 ml dioxánban oldva, 3. lombikhoz 1 ml tetrahidrofurfurilalkoholban oldva, 4. lombikhoz 1 ml dimetilformamidban oldva, 5. lombikhoz 1 ml dimetilacetamidban oldva, 6. lombikhoz 1 ml dimetilszulfoxidban oldva, 7. lombikhoz 1 ml piridinben oldva, 8. lombikhoz 1 ml hexametilfoszforsavtriamidban oldva. Ezután a lombikokat 37 °C-on rázatjuk három napig, majd a tenyészeteket kétszer 50—50 ml kloroformmal extraháljuk. Az extraktum kvalitatív és kvantitatív kiértékelését rétegkromatográfiás úton végezzük. Rétegkromatográfia: Kieselgel HF2s4 (Merck, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) 0,25 mm vastagságú rétegen futtatunk telített gőzterű kádban, primer glükozidok esetén kloroform-metanol 90 :10 rendszerben (1), szekunder glükozidok esetén etilacetát-hexán-abszolút etanol 55 :35 :10 rendszerben (2), háromszor futtatva. A kromatogramok kvalitatív kiértékelését ánizsaldehid reagens (500 ml 99,6%-os ecetsav, 3 ml ánizsaldehid és 4 ml koncentrált kénsavj segítségével végezzük. Az 1. táblázatban bemutatjuk a glükozidok Rf és Rs (digitoxinra vonatkoztatott) adatait, valamint az ánizsaldehid reagenssel adott jellemző szint. 1. táblázat Glükozid R? R| (digitoxin) Ánizsaldehid reagenssel adott szín digitoxin 0,61 1,0 szürkéskék digoxin 0,43 0,7 kék 7/3-hidroxidigoxin 0,34 0,56 ibolyáskék Az extraktum glükozid-tartalmát a rétegkromatográfiás elválasztást követően dixantilkarbamiddal képzett szín fotometrálásával határozzuk meg az alábbi módon: A vizsgálandó mintából annyit visszünk a rétegre, hogy a felcseppentett térfogat 10-50 Mg mennyiséget tartalmazzon az egyes glükozidokból. Futtatás után a réteget gondosai} kiszárítva, a kromatogramot jódgőzben előhívjuk. A foltokat a standard-eknek megfelelően bejelöljük, majd a jódot az adszorbensről légáramban elszublimáltatjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
