176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
13 176225 14 súlyát lemérjük és belőlük mintát veszünk. A glukagon közbenső kristályok kitermelése: 1. termékrészlet, 1/ 41,0 g (91,7% tisztaság) és 2/ 44.0 g (86,8% tisztaság), vagy 85,0 g (89,1% tisztaság), 75,8 g glukagon, 642 jug eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként 730 Mg, első újrafeldolgozásból nyert kristályok (2. termékrészlet) kitermelése: 19,0 g (100,0% tisztaság), 165 Mg eredeti pankreász-szövet-kilogrammonként második újrafeldolgozásból nyert kristályok (1. anyalúgok) kitermelése: 22,0 g (46,0% tisztaság) vagy 9,9 g, 85,8 jug eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként (tiszta) vagy 187 jug (tisztítás nélkül). Összes kitermelés: 126,0 g szilárd anyag (1047 jagt eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként), 83,1% tisztasággal, vagy 104,7 g glukagon (900 Mg hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként. Az átkristályosítást az összegyűlt más közbenső kristályokkal közösen végezzük el. A végső glukagonkristályok a közbenső kristályokban jelenlevő glukagon súlyának 85%-át képezik,Az átkristályosítást pH 7,5-nél hajtjuk végre, miután a közbenső kristályokat pH 8,0—10,0 között 10%-os kálium-hidroxid-oldattal 40°-on feloldottuk (1,0% szilárd anyag tartalom), a pH-t 10%-os foszforsavval 7,5-re állítjuk be, az oldatot szűrjük és hűtjük. A végső kristályokat az anyalúg főtömegének dekantálása után centrifugálással összegyűjtjük (az anyalúgot további kristálykinyerés céljából újra feldolgozzuk), 0,001%-os nátrium-klorid-oldattal kétszer, hideg desztillált vízzel egyszer mossuk és gyorshűtéses fagyasztással szárítjuk. A számított kitermelés 89.0 g vagy 765,6 jug eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként és a lúgos kristályosításkor kapott anyalúgból való kinyerés 33,2%. 3. példa 425 liter lúgos kristályosítási felülúszót, melynek pH-ja 7,5, és 65 mikrogramm/ml glukagont tartalmaz, alkáli- vagy alkálifém ciklusban működő szulfonált makroretikuláris sztirol-divinilbenzol-kopolimerrel (Amberlite 200) töltött ioncserélő oszlopon vezetjük át. A 630 liter glukagont tartalmazó frakció 4047 g szilárd anyagot, és 33,6 g glukagont tartalmaz. Ezen frakció 32 literjét pH = 3 értéken 4,38 literre pároljuk be. A koncentrátumhoz pH = 9,5 érték eléréséig híg kálium-hidroxid-oldatot adunk. A keletkezett oldat 82,5 g szilárd anyagot, és 1,3 g glukagont tartalmaz. Az oldat egyik felét, mely 0,65 g glukagont 5 tartalmaz, pH = 2,1 értékre állítjuk be, híg sósavval, majd 2,2 ml/liter mennyiségben fenolt, 4 ml/liter mennyiségben 0,1 n etiléndiamin-tetraecetsav-nátriumsót és 6 ml/liter mennyiségben 50%-os ammónium-szul' fát oldatot adunk hozzá. Az elegyet 2 napon át szo- 10 bahőmérsékleten kevertetjük. A kapott glukagonszálakat az anyalúgtól centrifugálással elválasztjuk. Ily módon 0,42 g glukagont kapunk. A szálas frakciót híg káliumhidroxid-oldatban oldva 212 ml, 1,89 g szilárd anyagot, és 15 0,307 g glukagont tartalmazó oldatot kapunk. Az oldatot 60 °C hőmérsékletre melegítjük, és a pH-t sósavval 5,0 értékre állítjuk be. Az oldatot ezután 5 °C hőmérsékleten 72 órán át állni hagyjuk. A csapadékot szűréssel elválasztjuk. Az anya- 20 lúg 0,004 g glukagont tartalmaz. A csapadék súlya 1,35 g, mely 0,157 g glukagont tartalmaz. (Kitermelés: 24%). 25 Szabadalmi igényont: Eljárás glukagon előállítására glukagon-tartalmú oldatból, melynek során 30 1. a glukagon-tartalmú fehérjét oldatából a) 4,2—6,6 pH-n legfeljebb 20 tf% 1 —4 szénatomos alkanol jelenlétében végzett izoelektromos ponton történő kicsapással, vagy b) ioncserélő kromatográfiával, a glukagon-tartal-35 mú fehéijét adszorbensen megkötve, majd az adszorbenst híg bázissal — előnyösen 0,1 n ammónium-hidroxid-oldattal — eluálva, vagy c) az a) eljárásváltozat szerinti izoelektromos ponton történő kicsapás termékének a kicsapást 40 követő, enyhén lúgos — előnyösen legfeljebb 8,5 pH-értékű - fenolos vizes oldatból történő kisózásával izoláljuk, 2. a kapott szilárd anyag oldatából a glukagont valamely szervetlen só, előnyösen ammónium-szul-45 fát hozzáadásával pH 1,5-2,7 tartományban elválasztjuk a többi fehérjétől, és 3. a 2. lépésben kapott glukagont feloldjuk, és 4,5-8,5 pH-értéken, 2-10 mg/ml glukagon-koncentráció mellett végzett egy vagy több kristályosítással 50 tisztítjuk, azzal jellemezve, hogy glukagon-tartalmú oldatként az inzulin előállításánál alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszót használjuk. 1 rajz A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 814078 - Zrínyi Nyomda, Budapest 7
