176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
9 176225 10 sebben 40 °C körül hajtjuk végre. A glukagon koncentrációja előnyösen körülbelül 10 mg/ml. Szükség esetén a kristályosítás után kapott felülúszók valamelyikét vagy mindegyikét visszavezethetjük a folyamatba. Például a felülúszókban oldott fehérjéket kicsaphatjuk, ha a pH-t híg sósavval 2,5—3,0-ra állítjuk be és 20% nátrium-kloridot (súly/térfogat) adunk hozzá. A csapadékon elvégezzük a találmány szerinti eljárás 1. lépését, akár különállóan, akár a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóban feloldva. Mint említettük, a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó általában több oldott inzulint, mint glukagont tartalmaz. Ez az inzulin az izoelektromos ponton végzett kicsapáskor kapott glukagontartalmú fehérje komponense. Bár az eljárás 2. lépése, vagyis a glukagon más fehérjéktől való elválasztása, hatásosan választja el a glukagont az inzulintól, de az elválasztási eljárás károsíthatja a fehérjekeverék inzulin-komponensét. Ezért gyakran kívánatos az eljárás 1. lépését ioncserélő kromatográfia segítségével végrehajtani, ami ugyancsak az inzulin és a glukagon szétválasztásához vezet. Hangsúlyozni kell azonban, hogy az ioncserélő kromatográfia nem az egyetlen módszer az inzulinnak a glukagontól való elválasztására, mielőtt a glukagont a többi fehérjétől elválasztanánk. így például az izoelektromos ponton végzett kicsapáskor kapott üledéken az úgynevezett hiperglikémiás faktor frakcionálási is elvégezhetjük. Ez röviden a glukagonnak enyhén lúgos, fenolos közegből való kisózásából áll. A hiperglikémiás faktor frakcionálását Staub és munkatársai írták le a már idézett közleményükben. Az inzulintartalmú felülúszót visszavezetjük az inzulinelőállító folyamatba, míg a kicsapott nyers glukagont a találmány szerinti eljárás 2. lépésében használjuk. Bár a találmány szerinti eljáráshoz nem alapvetően fontos, de előnyös, ha a szálképző lépés felülúszóját visszavezetjük az inzulintermelő folyamatba, szokásosan az említett 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban leírt lúgos kristályosítási lépés kezdetén. Természetesen erre a visszavezetésre nincs szükség, ha a fentiek szerint az inzulint a szálképzés előtt elválasztjuk a glukagontól. A találmány szerinti eljárás és az inzulinelőállító eljárással való kapcsolata talán jobban megérthető a találmány szerinti eljárás kivitelét bemutató folyamatábra alapján. Az egyszerűség kedvéért az eljárás 1. és 3. lépése után kapott felülúszókat a rajz szerint elöntjük, de — mint említettük - ezek a felülúszók a folyamatba visszavezethetők. A 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás lúgos kristályosítását a rajz felső része mutatja. A lúgos kristályosítási elljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulint eredményez. Mivel a lúgos kristályosítási eljárás és az általa kapott alkálifém- vagy ammónium-inzulin az inzulinelőállító folyamat részét képezi, ezt az eljárást és az inzulint jelképező kockákat a rajzon szaggatott vonallal vettük körül és „inzulinos eljárás”-ként jelöljük. Minden, ami a szaggatott vonalon kívül esik, a találmány szerinti eljárás része és „glukagonos eljárás”-ként szerepel. Az eljárás - mint látható — a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóval kezdődik. Az eljárást képező, előnyben részesített lépéseket végrehajtva kapjuk meg az izoelektromos csapadékot, a glukagonszálakat, illetve a kristályos glukagont. A rajz a szálképző lépés felülúszójának az inzulinelőállító folyamatba való visszavezetését is mutatja. Ha másként nem jelezzük, minden hőmérséklet °C-t jelent. 1. példa 5,850 kg szarvasmarha/sertés-pankreász feldolgozásából származó 14,75 liter lúgos kristályosítási felülúszó hoz - melynek szilárd anyag tartalma 40,7 mg/ml (pH-értéke 8,6) — 1,45 liter abszolút alkoholt adunk. Az oldat pH-ját 3 n sósavoldattal 5,2- -re állítjuk be. Az oldatot éjszakán át 5°-on tartjuk. A képződött csapadékot szűréssel összegyűjtjük, 0,2% (súly/térfogat) fenolt tartalmazó 11,28 liter 0,01 n sósavoldatban (a továbbiakban savas fenolos víz) oldjuk és az oldatot elemezzük: összes szilárd anyag 512,6 g (45,4 mg/ml) inzulin 87,43 E/ml (1,93 E/mg szilárd anyag) glukagon 463,7 mg/ml (az összes szilárd anyag 1,02%-a). Az oldat 870 ml-es részletéből végezzük el a meghatározásokat. A visszamaradó 10,4 liter körülbelül 473 g szilárd anyagot tartalmaz. A „hiperglikémiás faktor” frakcionálásához a fenti oldatot 111,8 liter savas fenolos vízzel hígítjuk, a kapott 122,2 liter össztérfogat 0,387% szilárd anyagot tartalmaz. A felhígított oldathoz 245,8 ml folyékony fenolt, 941 g nátrium-kloridot és annyi 40%-os vizes nátrium-hidroxid-oldatot adunk, hogy a szilárd anyagok oldódásának elősegítése céljából az oldat pH-ja 9,0 legyen. Ezután a pH-t 3 n sósavoldattal 7,5-re állítjuk be. A kapott oldatot 1 —2 napig 5°-on tartjuk. A képződött csapadékról a felülúszót dekantáljuk és szivatással leszűrjük. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. A szűréssel és centrifugálással kapott szilárd anyagokat egyesítjük és 10 liter savas fenolos vízben oldjuk, a kapott oldat elemzése: Összes szilárd anyag 75,0 g (7,5 mg/ml) inzulin 6,33 E/ml glukagon 275 mcg/ml (az összes szilárd anyag 5,01%-a). Az oldatot 5 liter savas fenolos vízzel hígítjuk, hogy a szilárd anyag koncentrációja 5,0 mg/ml legyen. Az oldat 5,0 literes részletéből végezzük el a próbákat. A visszamaradó 10,0 liter körülbelül 50 g szilárd anyagot tartalmaz. A visszamaradt oldathoz keverés közben 8,0 ml 0,5 mólos vizes tetranátrium-etilén-diamin-tetraacetátot és 60 ml 50%-os vizes ammónium-szulfát-oldatot adunk. A keveréket környezeti hőmérsékleten 16 óráig keverjük. A képződött glukagonszálakat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
